張騰飛　艾地云　等

摘要：采用口服、腿部肌肉注射兩種不同攻毒方法，對空腸彎曲菌人工感染雞的致病性進(jìn)行研究。結(jié)果表明，兩種攻毒方法攻毒雞只均無臨床癥狀，但是均表現(xiàn)腸道的病理變化。攻毒后第三天、第五天可從雞泄殖腔棉拭子和迫殺雞樣品的空腸中分離到目的菌落。

關(guān)鍵詞：空腸彎曲菌；雞；致病性

中圖分類號：S858.31 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2015）15-3703-02

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.15.031

Abstract： By oral administration and nasal drip， intramuscular injection， the pathogenicity of Campylobacter jejuni on chicken were studied. The test showed that the infected chicken did not show obvious clinical symptoms except enteric pathological changes. After 3 days and 5 days post inoculation， Campylobacter jejuni were isolated from jejunum and cloacae swabs.

Key words： Campylobacter jejuni；chicken；pathogenicity

空腸彎曲菌（Campylobacter jejuni）是彎曲菌屬中引起人類感染最為嚴(yán)重的致病菌，是導(dǎo)致食物中毒的主要病原菌之一[1]，近些年來，彎曲菌感染率在世界各地普遍呈上升趨勢，已成為最常見的、急性細(xì)菌性腸道傳染病。雞是彎曲菌重要的貯存宿主，人類主要通過食用被污染的水、乳制品及食物感染，因此控制雞群彎曲菌的攜帶率是控制人彎曲菌病的重要前提。本研究主要對空腸彎曲菌人工感染雞的致病性進(jìn)行研究，為彎曲菌病的流行病學(xué)調(diào)查及防控提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)菌及培養(yǎng)基 空腸彎曲菌（CICC22936）、mCCDA、布氏肉湯，購自北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院，DL2 000 DNA Marker、2×EasyTaq PCR SuperMix購自北京全式金生物制品有限公司，CampyGenTM微需氧產(chǎn)氣袋購自O(shè)xoid公司。

1.1.2 試驗雞 SPF雞蛋購自北京梅里亞維通實驗動物技術(shù)有限公司，購買回來后孵化，飼養(yǎng)觀察，用于后續(xù)試驗。

1.2 方法

1.2.1 接種 將空腸彎曲菌劃線接種于mCCDA平板放入?yún)捬豕拗?，將產(chǎn)氣袋放在厭氧罐的指定位置，立即封閉厭氧罐，42 ℃培養(yǎng)48 h。挑取單菌落于布氏肉湯中，42 ℃培養(yǎng)48 h，計算菌落數(shù)。

1.2.2 攻毒 將布氏肉湯培養(yǎng)物采用兩種攻毒方式攻毒1月齡雞，一種攻毒方式為口服，另一種攻毒方式為腿部肌肉注射，6只/組，5×108 CFU/只；對照組接種滅菌生理鹽水，3只，0.3 mL/只；飼養(yǎng)觀察1周后迫殺，同時于攻毒后第三天、第五天肛拭子采樣分菌。

1.2.3 PCR產(chǎn)物的擴(kuò)增和產(chǎn)物鑒定 根據(jù)Genbank序列，參照何蕊等[2]的方法，合成空腸彎曲菌mapA基因引物，擴(kuò)增片段長度為589 bp。引物序列如下：上游引物5′-CTATTTTATTTTTGAGTGCTTGTG-3′，下游引物5′-GCTTTATTTGCCATTTGTTTTATTA-3′。由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

模板的制備：將空腸彎曲菌和其他待檢菌株加入含抗生素和生長促進(jìn)劑的布氏肉湯中微需氧法培養(yǎng)48 h，取菌液1 mL，10 000 r/min離心10 min，棄上清，加1 mL去離子水重懸沉淀，沸水浴10 min，同樣離心后取上清液作模板，于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

PCR反應(yīng)體系：在PCR反應(yīng)管中加入2×Easy Taq PCR SuperMix 25 μL、上下游引物各1μL、DNA模板4 μL，加去離子水補(bǔ)至50μL。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，59 ℃退火30 s，72 ℃延伸50 s，35個循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。反應(yīng)完畢后擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 臨床表現(xiàn)及剖檢病變

所有攻毒雞只精神食欲正常?？诜M迫殺雞主要剖檢病變?yōu)槭改c、空腸黏膜散在分布針尖大小出血點；腿部肌肉注射組迫殺雞主要剖檢病變?yōu)殡u只十二指腸黏膜散在分布針尖大小出血點；其他組織無肉眼可見病變。對照組雞只精神食欲正常，剖檢無肉眼可見病變。

2.2 細(xì)菌分離結(jié)果

攻毒后第三天、第五天雞泄殖腔棉拭子樣品及迫殺雞只的空腸內(nèi)容物接種mCCDA，平板上有灰色菌苔生長。挑取灰色菌落劃線接種mCCDA，42 ℃培養(yǎng)48 h，有灰色單菌落生長。挑取單菌落進(jìn)行純化，純化的細(xì)菌革蘭氏染色為紅色、細(xì)小的S形短桿菌。從迫殺雞只的肝臟、腦中未分離到空腸彎曲菌。從對照組雞只中未分離到空腸彎曲菌。

2.3 PCR鑒定結(jié)果

對從攻毒后第三天、第五天泄殖腔棉拭子樣品及迫殺雞只的空腸中分離菌進(jìn)行PCR擴(kuò)增，均可擴(kuò)增到約為589 bp片段（圖1），而陰性對照無條帶。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送上海生工測序，測序結(jié)果表明，與陽性對照（攻毒菌株）的mapA基因序列比較，同源性可達(dá)99%以上。

3 小結(jié)與討論

本研究采用兩種方式攻毒，一種攻毒方式為口服，這種方式是模擬家禽自然感染彎曲菌的途徑進(jìn)行，空腸彎曲菌作為一種消化道傳播病原菌，主要通過消化道進(jìn)行感染[3-5]；另一種攻毒方式為腿部肌肉注射，這也是進(jìn)行攻毒試驗常用的一種方式，但在空腸彎曲菌攻毒試驗中少見報道，本研究加上肌肉注射組，其目的是研究空腸彎曲菌能否通過肌肉注射對雞進(jìn)行感染。試驗結(jié)果表明，肌肉注射和口服兩種攻毒方法均未引起雞只產(chǎn)生明顯臨床癥狀，這與部分報道[3，4，6，7]禽在自然或試驗條件下感染彎曲菌但不引起臨床疾病是一致的。兩種攻毒方法雞只雖不產(chǎn)生明顯的臨床癥狀，但是均表現(xiàn)腸道的病理變化，迫殺雞只剖檢后腸道尤其是十二指腸都有明顯的病變，其他組織如腦、肝臟等均無肉眼可見病變。國外有研究報道[3，4]，禽感染空腸彎曲菌后，能夠在腸道的苛刻條件下定居，甚至到達(dá)下段腸道。本研究感染雞只引起的腸道病變可能與空腸彎曲菌主要定植在禽的腸道有關(guān)?？漳c彎曲菌在雞體內(nèi)的定植規(guī)律及雞只感染發(fā)病的機(jī)理有待于進(jìn)一步研究。

雞感染空腸彎曲菌后，向外界排泄菌，從而對人類和其他動物造成持續(xù)感染[4，8，9]。肛拭子采樣方便、快捷，本研究采用肛拭子采樣方法從攻毒后第三天、第五天雞體采集樣品進(jìn)行空腸彎曲菌的分菌，經(jīng)過培養(yǎng)特性、形態(tài)學(xué)觀察和PCR檢測，鑒定為空腸彎曲菌，提示攻毒空腸彎曲菌的雞在感染后可很快隨糞便向外界排泄菌，同時也證實了泄殖腔拭子采樣可作為進(jìn)行禽空腸彎曲菌病流行病學(xué)調(diào)查活禽采樣的方法[8，10]，為今后進(jìn)行禽彎曲菌病的防控提供理論依據(jù)。

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