李霞 譚克剛 任道援等

摘要：參照《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》（2004A）建立了基于HPLC的貴州鳳岡鋅硒茶標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜R，并與其他地區(qū)的同類樣品進(jìn)行對比分析。結(jié)果顯示，標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜能夠反映出貴州鳳岡鋅硒綠茶HPLC圖譜的共性，相似度分析能明顯區(qū)分鳳岡鋅硒綠茶樣品與參比樣品（以相似度0.9進(jìn)行劃分）；系統(tǒng)聚類的方法可以將貴州鳳岡鋅硒綠茶與參比樣品區(qū)分，且能反映樣品產(chǎn)地區(qū)別。散點(diǎn)圖能夠顯示鳳岡鋅硒綠茶樣品與參比樣品的區(qū)別。結(jié)果可為鳳岡鋅硒綠茶的真?zhèn)舞b別、質(zhì)量評價提供參考。

關(guān)鍵詞：鳳岡鋅硒綠茶；HPLC；指紋圖譜

中圖分類號：S571.1；O657.7+2 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2015）14-3513-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.14.047

Identification Zinc and Selenium Green Tea from Guizhou Fenggang

Based on HPLC Fingerprints

LI Xia， TAN Ke-gang， REN Dao-yuan， FENG Fa-qing， XIANG Li-ping， WANG Ao

（Institute of Product Quality Inspection & Testing of Zunyi， Zunyi 563000， Guizhou， China）

Abstract： According to the standard operating procedure of similarity evaluation system for chromatographic fingerprint of TCM （Version 2004A）， the standard fingerprint R of zinc and selenium tea from Guizhou Fenggang was established based on HPLC. The results indicated that the standard fingerprint of zinc and selenium tea from Guizhou Fenggang could reflect its internal components in common. Similarity analysis clearly distinguished the zinc and selenium tea from Guizhou Fenggang from the reference samples（divided to similarity of 0.9）；System clustering method could also showed this difference and the sample origin in all samples. Scatter diagram showed a separation of zinc and selenium tea from Guizhou Fenggang in 59 samples. The results provide the reference for identification and quality evaluation of zinc and selenium tea from Guizhou Fenggang.

Key words： zinc and selenium tea from Guizhou Fenggang； HPLC； fingerprint profile

位于貴州遵義的鳳岡縣是貴州省重要的茶產(chǎn)區(qū)之一，其綠茶產(chǎn)品“鳳岡鋅硒茶”于2006年獲得地理標(biāo)志產(chǎn)品，其特點(diǎn)是同時含鋅硒微量元素（其中鋅含量40～100 mg/kg，硒含量0.05～2.5 mg/kg），這一方面可提高茶葉中兒茶素的生理活性，增強(qiáng)其抗氧化、抗癌等保健作用[1]，另一方面也可影響茶樹生理活動，調(diào)控植株對不同物質(zhì)的吸收-分配-積累[2-5]，影響到茶葉的品質(zhì)、風(fēng)味等，進(jìn)而形成相對獨(dú)特的指紋圖譜[6-8]。

基于高效液相色譜（HPLC）的指紋圖譜方法已成為中藥研究和鑒定的主要手段[9，10]。通過指紋圖譜不但能夠全面反映中藥內(nèi)在化學(xué)成分的特征和品質(zhì)，還為其真?zhèn)舞b別提供了理論基礎(chǔ)[11-13]。目前，茶葉品鑒多依賴感官評定方法，易受評定人員主觀經(jīng)驗(yàn)的限制，采用儀器分析各種品質(zhì)指標(biāo)，由于客觀且重現(xiàn)性好，是茶葉真?zhèn)舞b別、品質(zhì)評定的發(fā)展趨勢。本試驗(yàn)以鳳岡鋅硒茶為對象，運(yùn)用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》建立基于HPLC的標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜模型[14，15]，并對模型適用性進(jìn)行分析評價[16]，以期為鳳岡鋅硒綠茶的真?zhèn)舞b別、品質(zhì)分析等提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

于2012-2013年，依據(jù)鳳岡富鋅富硒茶地理標(biāo)志產(chǎn)地所界定的地域范圍，在貴州省遵義市鳳岡縣田壩隨機(jī)抽取了29個鳳岡鋅硒綠茶（Fg）樣品。所有樣品均為獨(dú)芽、依照鳳岡富鋅富硒茶加工工藝進(jìn)行制作，樣品經(jīng)粉碎機(jī)粉碎、過20目篩后密封備用。同時，收集了貴州其他地區(qū)，且原料、加工工藝與鳳岡鋅硒綠茶接近的綠茶樣品共23個，其來源為：銅仁9個（Tr），都勻5個（Dy），六盤水4個（Lps），湄潭5個（Mt）。所有樣品經(jīng)粉碎機(jī)粉碎、過40目篩后密封備用。

1.2 儀器

1260型高效液相色譜儀（Agilent，美國）配備二極管陣列檢測器。

1.3 方法

1.3.1 樣品前處理 分別稱取樣品0.250 0 g，加70%（V/V）甲醇20.0 mL，經(jīng)超聲處理30 min后，0.45 μm濾膜過濾，待測。

1.3.2 液相條件 色譜柱為Zorbax Eclipse Plus C18 栓（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為乙腈（A），0.3%（V/V）冰乙酸（B），梯度洗脫（0 min 5%A，3 min 5%A，4 min 14%A，21 min 14%A，26 min 15%A，34 min 15%A，40 min 17%A，45 min 25%A，55 min 25% A，V/V）；流速0.5 mL/min；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量10 μL；檢測波長365 nm。

1.3.3 結(jié)果計(jì)算 采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)分析數(shù)據(jù)，用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》2004A版作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜模型R

在《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》2004A版中，按80%以上樣品共有峰為樣品集共有峰；參考中藥色譜指紋圖譜構(gòu)建方法，以峰面積相對較大的13號峰為參照峰S，生成共有模式作為鳳岡鋅硒綠茶HPLC標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜模型R，如圖1所示。由圖1可知，樣品的HPLC色譜峰基線平穩(wěn)、色譜峰峰形、分離效果均較好，且不同樣品間有明顯的共有峰。

2.2 相似度分析

相似度作為指紋圖譜評價的一個參數(shù)，已被國家藥典委員會確定為中藥指紋圖譜標(biāo)準(zhǔn)中的一項(xiàng)重要評價指標(biāo)。相似度的計(jì)算主要采用相關(guān)系數(shù)法及向量夾角余弦法。以鳳岡鋅硒綠茶標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜作為對照，以參比樣品色譜峰的相對保留時間和峰面積為因子，利用SPSS軟件計(jì)算52批貴州不同產(chǎn)地綠茶樣品HPLC數(shù)字化指紋圖譜的相關(guān)系數(shù)和向量夾角余弦，結(jié)果如表1所示。

由表1可知，利用相關(guān)系數(shù)及夾角余弦2種方式計(jì)算出的指紋圖譜的相似度均可以表示圖譜間的相似性。貴州鳳岡鋅硒綠茶HPLC對照指紋圖譜與29批貴州鳳岡鋅硒綠茶標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜R相似度均大于0.9，與六盤水、都勻、湄潭、銅仁等貴州其他產(chǎn)地綠茶相似度均小于0.9，相似度結(jié)果容易將貴州鳳岡鋅硒綠茶與貴州其他產(chǎn)地綠茶區(qū)分開來。

2.3 聚類分析

在相似度分析的基礎(chǔ)上，利用SPSS軟件對52個貴州綠茶樣品HPLC數(shù)字化指紋圖譜的全部成分進(jìn)行系統(tǒng)聚類。選用歐氏距離作為樣品間相似性的測度，采用質(zhì)心聚類法聚類分析，結(jié)果如圖2。由圖2可知，52個樣品系統(tǒng)聚類的結(jié)果可分為2大類：Mt1～5號、Dy1～5號、Tr1～9號和Lps3～4號綠茶為第1大類，其與貴州鳳岡鋅硒綠茶HPLC對照指紋圖譜相關(guān)系數(shù)和夾角余弦均小于0.8；第1大類又可分為2小類，Tr1～5、Tr8～9、Dy5、Mt4號綠茶為1小類，除Dy5、Mt4號外均采自貴州銅仁綠茶；Dy1～4、Tr6～7、Mt1～3、Mt5、Lps3～4號綠茶為2小類。Fg1～29號綠茶和Lps1～2號綠茶分為第2大類，其與貴州鳳岡鋅硒綠茶HPLC對照指紋圖譜相關(guān)系數(shù)和夾角余弦均大于0.8，且Fg1～29號綠茶與貴州鳳岡鋅硒綠茶HPLC對照指紋圖譜相關(guān)系數(shù)和夾角余弦均大于0.9；除Lps1～2號綠茶采自六盤水外其余綠茶均采自貴州鳳岡。經(jīng)考察，Lps1～2號樣品種源來自貴州鳳岡，造成相似度大的原因可能是種源的因素。通過以上分析可知，利用系統(tǒng)聚類方法很容易將貴州鳳岡鋅硒綠茶與貴州其他地區(qū)綠茶區(qū)分開來，且可以對貴州不同產(chǎn)地綠茶進(jìn)行歸類。

2.4 主成分及二維排序分析

利用SPSS軟件的主成分分析函數(shù)分析52個樣品，結(jié)果見表2和表3。通過對主成分貢獻(xiàn)的分析可知，由于茶葉內(nèi)含成分較多，對茶葉品質(zhì)的影響因素不是單一的，此色譜條件下測定的貴州綠茶指紋圖譜茶葉主成分達(dá)到了3個。PC1～PC3的貢獻(xiàn)率分別為69.621%、13.001%、6.9765%，累計(jì)貢獻(xiàn)率為89.587%，其他成分的貢獻(xiàn)率相對較小，從累計(jì)貢獻(xiàn)率來看，根據(jù)主成分分析原理，取前3個為主要成分足可以說明各指標(biāo)信息。由特征向量表（表3）可以看出，PC1主要反映了原始圖譜的3號、5號、8號和13號色譜峰的信息，PC2主要反映了原始圖譜的6號、7號、10號和15號色譜峰的信息。

以52個樣品的第1主成分作縱坐標(biāo)，以第2主成分為橫坐標(biāo)，利用SIMCA-P+12軟件作成散點(diǎn)圖（圖3），由散點(diǎn)圖可以直觀顯示出貴州鳳岡鋅硒綠茶樣品與貴州其他產(chǎn)地綠茶樣品不同。Fg1～29號綠茶均采自貴州鳳岡，品質(zhì)相近，在散點(diǎn)圖上基本聚在一起，且與采自貴州其他產(chǎn)地的綠茶在散點(diǎn)圖上相距較遠(yuǎn)。貴州其他產(chǎn)地的綠茶除Lps1～2號、Dy5號及Mt4號綠茶外，在散點(diǎn)圖上也基本聚集在一起。

3 小結(jié)

以HPLC為基礎(chǔ)，用二極管陣列檢測器（DAD）在365 nm處分析，能夠獲得鳳岡鋅硒茶樣品內(nèi)含物特征及其與參比樣品的差異。經(jīng)方法基線平穩(wěn)，且總體峰面積較大，操作簡單、重復(fù)性好。相似度分析、聚類分析、主成分均顯示所建立的鳳岡鋅硒綠茶標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜R有相對獨(dú)特的特征，可為相關(guān)研究提供參考。

參考文獻(xiàn)：

[1] 趙保路.茶多酚的抗氧化作用[J].科學(xué)通報，2002，47（16）：1206-1210.

[2] 王小平，劉 鵬，羅 虹，等.鋁氟交互處理對茶葉品質(zhì)的影響[J].茶葉科學(xué)，2009，29（1）：9-14.

[3] 王小平，劉 鵬，羅 虹，等.鋁氟交互處理對茶樹生理特性的影響[J].園藝學(xué)報，2009，36（9）：1359-1364.

[4] 夏建國，蘭海霞，吳德勇.鉛脅迫對茶樹生長及葉片生理指標(biāo)的影響[J].農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報，2010，29（1）：43-48.

[5] 唐 茜，趙先明，杜 曉，等.氟對茶樹生長、葉片生理生化指標(biāo)與茶葉品質(zhì)的影響[J].植物營養(yǎng)與肥料學(xué)報，2011，17（1）：186-194.

[6] 王麗鴛，成 浩，周 健，等.綠茶數(shù)字化多元化學(xué)指紋圖譜建立初探[J].茶葉科學(xué)，2007，27（4）：335-342.

[7] 成 浩，王麗鴛，周 健，等.基于化學(xué)指紋圖譜的綠茶原料品種判別分析[J].中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008，41（8）：2413-2418.

[8] 楊曉莉，王聰慧，李菊華，等.HPLC法測定不同年份下關(guān)沱茶咖啡因的含量[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，38（31）：17463-17464.

[9] 沙 明，王嘉仡，曹愛民，等.HPLC指紋譜技術(shù)在中藥新藥質(zhì)量控制中的應(yīng)用[J].中草藥，2002，33（2）：87-89.

[10] 沙 明，張東方，孟憲生，等.DNA指紋譜與HPLC指紋譜對中藥地榆質(zhì)量評價研究[J].中國藥學(xué)雜志，2002，37（11）：15-18.

[11] 陳閩軍，瞿海斌，程翼宇.一類用化學(xué)指紋特征鑒別中藥材真?zhèn)蔚姆椒╗J].高等學(xué)?；瘜W(xué)學(xué)報，2003，24（12）：2181-2185.

[12] 陳閩軍，吳永江，范驍暉，等.色譜指紋圖譜分析技術(shù)用于鑒別中藥川芎產(chǎn)地[J].中國中藥雜志，2003，28（7）：23-27.

[13] 陶金華，狄留慶，文紅梅，等.中藥指紋圖譜譜效相關(guān)性研究思路探討[J].中國中藥雜志，2009，34（18）：2410-2413.

[14] 程翼宇，陳閩軍，吳永江.化學(xué)指紋圖譜的相似性測度及其評價方法[J].化學(xué)學(xué)報，2002，60（11）：2017-2021.

[15] 馮啟余，曹玉華，龔立冬.中藥指紋圖譜共有峰的自動識別[J].分析科學(xué)學(xué)報，2009，25（1）：41-46.

[16] 陳全勝，趙杰文，張海東，等.SIMCA模式識別方法在近紅外光譜識別茶葉中的應(yīng)用[J].食品科學(xué)，2006，27（4）：186-189.