劉 偉 ，劉 旭 ，張 鴻 ，鐘 奇 ，羅來友

（1.四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝研究所，四川 成都 610066；2.西北農(nóng)林科技大學(xué)葡萄酒學(xué)院，陜西 楊凌 712100；3.四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，四川 成都 610066；4.甘孜州康定紅葡萄酒業(yè)有限公司，四川 丹巴 626300）

葡萄是多年生藤本植物，為了提高產(chǎn)量和品質(zhì)，每年夏季葡萄進(jìn)入旺盛生長期、冬季進(jìn)入休眠期時(shí)都要對枝蔓進(jìn)行修剪，除極少數(shù)留作繁殖苗木外，大部分枝條（60%～70%）都被廢棄，造成了極大的資源浪費(fèi)。但同時(shí)葡萄枝條中富含白藜蘆醇和酚類物質(zhì)，研究發(fā)現(xiàn)[1]葡萄枝條中含有反式白藜蘆醇和葡萄素，Erkan[2]等亦報(bào)道葡萄枝條中含有白藜蘆醇和阿魏酸。白藜蘆醇和酚類物質(zhì)有很大的商業(yè)價(jià)值，對于中國乃至世界葡萄行業(yè)來說對其1a生枝條進(jìn)行回收利用有很大的必要性。

研究表明[3]葡萄廢棄物中含有大量以植物多酚為主的生物活性物質(zhì)由40多種化學(xué)成分組成，具有抗氧化、促進(jìn)腸胃消化、降低血脂肪；還能利尿、降血壓、抑制細(xì)菌與癌細(xì)胞生長，及幫助消化[4-5]。

白藜蘆醇又稱芪三酚，是非黃酮類的多酚化合物，白藜蘆醇是植物遭受紫外線照射、機(jī)械損傷等外界條件影響時(shí)合成的，是植物體在逆境時(shí)分泌的一種抗毒素[6]。1997 年 Jang[7]等在《SCIENCE》雜志上發(fā)表論文證明白藜蘆醇能有效抑制與癌癥各過程相關(guān)的細(xì)胞活動(dòng)。作為抗氧化劑、抗突變劑和抗炎劑，白藜蘆醇顯示出對癌癥的化學(xué)預(yù)防能力，能夠防止細(xì)胞癌病變，并通過阻止激酶功能而起抗突變作用。

許多研究已證實(shí)紫外線對葡萄中白藜蘆醇的合成具有誘導(dǎo)作用。Langcake P[8]研究發(fā)現(xiàn)，紫外線波長在白藜蘆醇的誘導(dǎo)過程中十分重要，1，2-二苯乙烯合成酶（Stilbene synthase，STS）對紫外線的感受區(qū)在260～270nm。Cantos E等[9]研究了不同的紫外線強(qiáng)度（IW）、輻射時(shí)間（IT）、輻射距離（ID）、處理時(shí)間（Dm）對葡萄中白藜蘆醇的影響。結(jié)果表明：IW=510W、IT=30s、ID=40cm、Dm=3d可以使葡萄中的白藜蘆醇提高11倍；李景明[10]研究也發(fā)現(xiàn)不同的紫外劑量對葡萄中的白藜蘆醇含量有很大的影響。在不同海拔地區(qū)，由于海拔高度的差異，紫外線強(qiáng)度的大小也不一樣，加之環(huán)境溫度、時(shí)間等的差異，會導(dǎo)致不同海拔地區(qū)葡萄1a生枝條中白藜蘆醇含量的差異。

目前對白藜蘆醇和其他多酚類物質(zhì)的提取主要是從皮渣、葡萄籽中提取，而對廢棄物更多的葡萄枝條則研究較少。本試驗(yàn)主要研究橫斷山區(qū)的葡萄1a生枝條的再利用，針對橫斷山區(qū)地勢起伏明顯的特點(diǎn)，研究對比不同品種不同海拔條件下總酚和白藜蘆醇的含量差異。

1 試驗(yàn)材料與方法

1.1 試驗(yàn)地概況

試驗(yàn)材料（赤霞珠和美樂的1a生枝條）均采自四川省阿壩州茂縣和甘孜州丹巴縣，兩地氣象資料如表1。

兩地的降雨主要集中在7～9月，而在葡萄成熟期降雨較少，同時(shí)兩地區(qū)的年最低溫度不低于-8℃，冬季葡萄樹不需要埋土防寒，有利于葡萄的生長。茂縣和丹巴除了最熱月均溫上很相近，其他各項(xiàng)指標(biāo)差別都比較大。尤其是年降雨量和活動(dòng)積溫，差值分別為92mm和498℃。由于這些氣候因子的不同，所以兩地區(qū)的1a生枝條酚類物質(zhì)和白藜蘆醇的含量可能存在較大差異，這也是本研究的出發(fā)點(diǎn)。

表1 丹巴和茂縣地區(qū)的氣象資料

1.2 試驗(yàn)材料與儀器

試驗(yàn)材料為不同海拔高度的赤霞珠和美樂的1a生枝條，枝條采收為2012年10月10日-2012年10月15日。其中赤霞珠1a生枝條6個(gè)樣品，美樂1a生枝條4個(gè)樣品，如表2。

表2 試驗(yàn)地海拔條件

試驗(yàn)儀器包括紫外分光光度計(jì)（UV-2450，日本島津）高效液相色譜儀（LC-2010AHT），超聲波清洗儀（KH-500DE，昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司），旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（RE-52A，上海亞榮生化儀器廠），電熱恒溫水浴鍋（HW.SY21-K，北京市長風(fēng)儀器儀表公司），葡萄枝條粉碎機(jī)1臺，離心機(jī)1臺，石英比色皿1套。

主要試劑：酸化甲醇 1mol/L（1500mL）、20%碳酸鈉溶液（1000mL）、20%乙醇（1000mL）。

1.3 測試指標(biāo)與方法

1.3.1 樣品預(yù)處理

將葡萄枝條用剪刀簡短至1cm左右，將剪短的枝條用粉碎機(jī)粉碎，并過0.5mm篩，將粉碎的葡萄枝條粉末放于自封袋-20℃貯藏，直至提取。

1.3.2 樣地土壤性質(zhì)測定

有機(jī)質(zhì)采用沖鉻酸鉀容量法-外加熱法；pH值采用pH計(jì)1:2.5水土比電位法測定；速效氮采用1.0M KCl浸提、AA3連續(xù)流動(dòng)分析儀測定；速效磷采用0.5M NaOH浸提、硫酸鉬銻抗比色法；速效鉀采用1.0M NH4OAc浸提、火焰光度法

1.3.3 總酚的測定方法

（1）標(biāo)準(zhǔn)曲線制作。用 10mL乙醇溶解0.5000g沒食子酸，定容至100mL，分別移取0、1.0、2.0、3.0、5.0、10.0mL 到 100mL 容量瓶中，用水定容。從上述不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液中分別移取1.0mL到100mL容量瓶中，再分別加入60mL去離子水，混合；加入5mL Folin-Ciocalteu試劑，混合；在0.5～8min內(nèi)，加入15mL20%碳酸鈉溶液，混合，定容。將上述標(biāo)準(zhǔn)溶液在20℃下放置2h后，在765nm波長下測定吸光值。以沒食子酸為標(biāo)準(zhǔn)溶液，所得標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=1.0069x-0.0141，決定系數(shù)R2為0.993，標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1。

圖1 酚類物質(zhì)總含量測定中沒食子酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線

（2）上清液提取。稱取粉末1.5g置于50ml離心管中，加入10mL甲醇，用超聲波處理10min，再用旋渦震蕩器震蕩15min，頻率為100Hz。在離心機(jī)中以9000r/min在4℃下離心10min，重復(fù)提取2次。

（3）總酚測定。取上述上清液1mL，定容至10mL。取1mL，按上述標(biāo)準(zhǔn)曲線測定方法，測定其吸光值。

（4）總酚含量計(jì)算。總酚含量（以沒食子酸GAE 相當(dāng)值表示）=C×V×n/M×100%，其中：C—沒食子酸濃度（mg/mL）；V—溶液體積（mL）；n—稀釋倍數(shù)；M—取樣量（mg）。

1.3.4 白藜蘆醇的測定方法

（1）上清液提取。稱取5.0g粉末于50mL離心管中，加入30mL酸化甲醇，搖床下20℃（水?。┱袷幪崛?h，然后在離心機(jī)中以8000r/min，4℃下離心15min，重復(fù)提取3次，合并上清液與長頸燒瓶中，35℃減壓濃縮至10mL，過0.22um尼龍濾膜，-20℃保存分析。

（2）白藜蘆醇的測定（液相色譜法）。在室溫下將樣品注入到Shim-PackVP-ODSC18柱（250mm×4.6mm，5μm），流動(dòng)相為3%的醋酸A和乙腈B，洗脫梯度：B:0.00～5.00min為 0～8.5%；5.00～16.50min為8.5%～2.0%；16.50～35.00min為2.0%～18%；35.00～50.00min為 18%～20%；50.00～65.00min為 20%～30%；65.00～70.00min為 30%～0%。流速為0.8mL/min，檢測波長為200～400nm，柱溫為30℃，進(jìn)樣量2uL。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣地土壤理化性質(zhì)

不同樣地土壤理化性質(zhì)如表3所示。由表3可見：在不同海拔地區(qū)，pH值相差比較小，且土壤都呈弱堿性。而有機(jī)質(zhì)含量變化比較大，范圍在16.72～76.48g/kg，說明不同地區(qū)土壤中成分差異比較大。其中水溶性Ca變化差異也比較大，范圍在100.94～851.03mg/kg，但是除了海拔1600m和2600m兩地區(qū)水溶性Ca含量特別高外，其他地區(qū)變化不是特別大。另外速效鉀的差別也比較大，變化范圍在45.48～416.97mg/kg，變化也特別大。各地區(qū)的有機(jī)質(zhì)含量的巨大差異，也使得在不同地區(qū)葡萄1a生枝條中酚類物質(zhì)含量的差異。

表3 樣地土壤基本理化性質(zhì)

2.2 不同海拔赤霞珠1a生枝條白藜蘆醇及總酚含量差異

從圖2可以看出：赤霞珠1a生枝條中酚類物質(zhì)總含量隨著海拔高度的不斷增加呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢。當(dāng)海拔高度為2280m時(shí)，酚類物質(zhì)總含量達(dá)到最大值，為2.254mg/g；當(dāng)海拔高度為1700m時(shí)，酚類物質(zhì)總含量最小，為0.7128mg/g。當(dāng)海拔高度低于2280m時(shí)，隨著海拔高度不斷增加，紫外線的照射不斷增強(qiáng)，溫度逐漸降低（海拔每上升100m，溫度降低0.6℃）[11]，本文分析認(rèn)為：在此區(qū)間內(nèi)，溫度對葡萄枝條中酚類物質(zhì)的影響可能小于紫外線的影響，隨著海拔高度增加，紫外線加強(qiáng)，利于葡萄1a生枝條中酚類物質(zhì)的合成。當(dāng)海拔高度高于2280m時(shí)，雖然紫外線強(qiáng)度持續(xù)增加，但是環(huán)境溫度不斷降低，影響葡萄枝條的光合作用，使得葡萄1a生枝條中酚類物質(zhì)合成受阻，導(dǎo)致其含量減少。

圖2 不同海拔赤霞珠1a生枝條美樂酚類物質(zhì)及白藜蘆醇含量的差異

不同海拔地區(qū)枝條中白藜蘆醇含量如圖2。在茂縣地區(qū)（圖2中1700～2100m），隨著海拔高度的不斷增加，赤霞珠1a生枝條中白藜蘆醇含量逐漸降低，當(dāng)海拔為1700m時(shí)，白藜蘆醇含量達(dá)到最大值0.206mg/g；當(dāng)海拔為2100m時(shí)，白藜蘆醇含量達(dá)到最小值0.116mg/g。在丹巴地區(qū)（圖2中2280～2600m），隨著海拔高度的不斷增加，赤霞珠1a生枝條中白藜蘆醇含量也不斷降低，當(dāng)海拔為2280m時(shí)，白藜蘆醇含量達(dá)到最大值0.190mg/g；當(dāng)海拔為2600m時(shí)，白藜蘆醇含量達(dá)到最小值0.052mg/g。

2.3 不同海拔美樂1a生枝條白藜蘆醇及總酚含量差異

不同海拔地區(qū)美樂1a生枝條酚類物質(zhì)和白藜蘆醇含量如圖3。美樂1a生枝條酚類物質(zhì)總含量隨著海拔高度的不斷增加而不斷增加，當(dāng)海拔高度達(dá)到最大值2390m時(shí)，酚類物質(zhì)總含量最大，為1.246mg/g。當(dāng)海拔高度不斷增加時(shí)，環(huán)境溫度在降低，紫外線強(qiáng)度不斷增加。分析認(rèn)為在此海拔區(qū)間內(nèi)，紫外線對美樂1a生枝條的影響大于溫度對美樂1a生枝條的影響，使得葡萄枝條能正常的光合作用，美樂1a生枝條中酚類含量也不斷增加。對比圖2和圖3，當(dāng)海拔高度為2280m時(shí)，赤霞珠1a生枝條酚類物質(zhì)總含量為2.254mg/g，美樂1a生枝條酚類物質(zhì)總含量為1.174mg/g；當(dāng)海拔高度為2390m時(shí)，赤霞珠1a生枝條酚類物質(zhì)含量為1.903mg/g，美樂1a生枝條酚類物質(zhì)含量為1.246mg/g。由此可得出，在此海拔區(qū)間內(nèi)，相同海拔地區(qū)的不同葡萄品種1a生枝條酚類物質(zhì)含量不同，且赤霞珠1a生枝條酚類物質(zhì)總含量大于美樂1a生枝條酚類物質(zhì)總含量。

圖3 不同海拔美樂1a生枝條酚類物質(zhì)及白藜蘆醇含量的差異

隨著海拔高度的不斷增加，美樂1a生葡萄枝條中白藜蘆醇含量也逐漸增加，當(dāng)海拔為1600m時(shí)，白藜蘆醇含量為最小值0.064mg/g，當(dāng)海拔為2390m時(shí)，白藜蘆醇含量達(dá)到最大值1.078mg/g。通過與圖2中赤霞珠白藜蘆醇含量的比較，當(dāng)海拔為1700m時(shí)，赤霞珠和美樂1a生枝條中白藜蘆醇很接近；當(dāng)海拔2000m時(shí)，美樂1a生枝條中白藜蘆醇含量明顯高于赤霞珠1a生枝條中白藜蘆醇的含量。

3 結(jié)論與討論

通過一定的方法對葡萄枝條中的白藜蘆醇和酚類物質(zhì)進(jìn)行有效提取，大大提高了枝條的回收利用價(jià)值，對1a生葡萄枝條的回收不僅能夠減少葡萄枝條的浪費(fèi)和所帶來的環(huán)境污染，還可以通過有效物質(zhì)提取增加葡萄種植戶的收入，提高其種植葡萄的積極性。本試驗(yàn)是以2013年采自四川茂縣和丹巴不同海拔地區(qū)的赤霞珠1a生枝條和美樂1a生枝條為原料。通過對不同海拔地區(qū)的不同品種1a生枝條中酚類物質(zhì)總含量和白藜蘆醇含量的測定，初步得出以下結(jié)論：

多酚類物質(zhì)是植物中化學(xué)物質(zhì)的總稱，因具有多個(gè)酚基團(tuán)而得名，對人體的健康有著重要的作用。研究表明[2]：葡萄皮中酚類物質(zhì)和白藜蘆醇含量分別在0.1～1.7mg/g和0.08～0.39mg/g之間。本研究表明：對于美樂葡萄品種而言，1a生枝條總酚含量隨著海拔高度的增加而逐漸增加；對于赤霞珠品種，1a生枝條中酚類物質(zhì)的總含量隨著海拔高度的逐漸增加呈現(xiàn)出先增加后減少的趨勢，當(dāng)海拔高度低于2280m時(shí)，1a生枝條總酚含量逐漸增加，在海拔高度2280m時(shí)達(dá)到最大值，當(dāng)海拔高度高于2280m時(shí)，1a生枝條總酚含量逐漸降低。本文認(rèn)為，隨著海拔高度的不斷增加，紫外線強(qiáng)度也在不斷增加，有利于酚類物質(zhì)的合成。但是當(dāng)海拔達(dá)到一定高度時(shí)，可能是溫度或者其它因子對葡萄枝條的影響更強(qiáng)，掩蓋了部分紫外線對葡萄枝條的影響，再加上溫度較低，光合作用也變?nèi)?，使得酚類物質(zhì)的合成受阻，所以海拔進(jìn)一步升高酚類物質(zhì)含量較低。

對美樂1a生枝條而言，白藜蘆醇含量隨海拔不斷升高而增加，分析認(rèn)為在此海拔范圍內(nèi)，紫外線的強(qiáng)度不斷增加，而且紫外線的作用明顯高于溫度等其它氣候因子的作用，使得白藜蘆醇含量和海拔高度成正相關(guān)。對赤霞珠1a生枝條而言，在茂縣地區(qū)和丹巴地區(qū)1a生枝條中白藜蘆醇含量都隨海拔高度增加而減少。分析認(rèn)為雖然隨著海拔升高紫外線強(qiáng)度不斷增加，但是溫度等其它因子的作用強(qiáng)于紫外線的作用，光合作用也比較低，導(dǎo)致枝條中白藜蘆醇含量的逐漸降低。

另外，在相同海拔地區(qū)，不同品種間白藜蘆醇含量不同，總體上美樂1a生枝條高于赤霞珠1a生枝條。

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