孫　棣，趙貴斌，楊　波（貴州省產(chǎn)品質(zhì)量檢驗(yàn)檢測(cè)院，貴州 貴陽(yáng) 550004）

醬香型白酒中吡嗪類化合物的檢測(cè)及特點(diǎn)

孫棣，趙貴斌，楊波
（貴州省產(chǎn)品質(zhì)量檢驗(yàn)檢測(cè)院，貴州 貴陽(yáng) 550004）

建立了白酒中8種吡嗪化合物的液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)方法。通過檢測(cè)結(jié)果找出醬香型白酒中吡嗪化合物的特點(diǎn)（8種吡嗪化合物中三甲基吡嗪和四甲基吡嗪含量較高），同時(shí)對(duì)真假茅臺(tái)酒酒樣中8種吡嗪化合物進(jìn)行測(cè)定，并將檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行分析，其中真茅臺(tái)酒四甲基吡嗪的含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他吡嗪化合物，含量在9.25～28.3 mg/L，假茅臺(tái)酒中四甲基吡嗪的含量在0.89～12.5 mg/L。該方法對(duì)提高醬香型白酒質(zhì)量及真?zhèn)尉频蔫b別提供參考。

液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用；醬香白酒；吡嗪類化合物

在白酒產(chǎn)業(yè)群中，醬香型白酒其香型、名聲和價(jià)值居首要位置，其生產(chǎn)工藝在中國(guó)白酒行業(yè)中具有唯一性。研究表明，醬香型白酒中吡嗪類化合物種類和含量最高，不僅是特征風(fēng)味物質(zhì)，其中四甲基吡嗪也是公認(rèn)的功能因子。其中吡嗪類化合物與醬香型白酒的感官特征密切相關(guān)，吡嗪含量高低從某種意義上來說也影響醬香白酒的品質(zhì)［1-5］。

目前關(guān)于白酒中吡嗪類化合物的檢測(cè)手段主要集中在氣相色譜和氣質(zhì)聯(lián)用法［6-12］，檢測(cè)方法較為單一，前處理過程較為復(fù)雜，需要經(jīng)過多次樣品轉(zhuǎn)移從而引起目標(biāo)化合物的損失，影響定量的準(zhǔn)確性。本研究建立了醬香型白酒中吡嗪類化合物的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（high performance 1iquid chromatography-tandem mass spectrometry，HPLCMS/MS）檢測(cè)方法，可以對(duì)醬香型白酒中主要的8種吡嗪類化合物進(jìn)行準(zhǔn)確定量，用建立的方法分別對(duì)31個(gè)醬香型白酒的代表酒樣進(jìn)行測(cè)定，找到了醬香型白酒中吡嗪類化合物的一些特點(diǎn)，同時(shí)也對(duì)同一規(guī)格的20個(gè)真茅臺(tái)酒和20個(gè)假茅臺(tái)酒分別進(jìn)行了測(cè)定，對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行了分析。通過研究找到醬香型白酒中吡嗪類化合物的共性和茅臺(tái)酒的特性，以保護(hù)我國(guó)名優(yōu)白酒、維護(hù)市場(chǎng)秩序、提高質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督部門的科技水平和真假酒的鑒別能力提供一些思路。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

2-甲基吡嗪（純度≥99.0%）、2，3-二甲基吡嗪（純度≥99.0%）、2，5-二甲基吡嗪（純度≥98.0%）、2，6-二甲基吡嗪（純度≥98.0%）、2，3，5-三甲基吡嗪（純度≥99.0%）、2-乙基-6-甲基吡嗪（純度≥95.0%）、2，3，5，6-四甲基吡嗪（純度≥99.0%）：美國(guó)Sigma公司；2，3-二甲基-5-乙基吡嗪（純度≥98.0%）：山東滕州華東生物科技有限公司；甲酸、三氟乙酸、甲醇均為色譜純：德國(guó)Merck公司。醬香型代表酒樣：生產(chǎn)企業(yè)提供；真茅臺(tái)酒、假茅臺(tái)酒：檢測(cè)機(jī)構(gòu)提供。

1.2儀器與設(shè)備

4000QTRAP三重四級(jí)桿質(zhì)譜聯(lián)用儀：美國(guó)AB Sciex公司；Agi1ent1260高效液相色譜儀：美國(guó)Agi1ent公司；N60M氮?dú)獍l(fā)生器：美國(guó)PEAK公司；Mi11i-Q Academic超純水系統(tǒng)：密理博（中國(guó)）有限公司。

1.3方法

1.3.1標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液及工作液的配制

準(zhǔn)確稱取適量8種吡嗪化合物標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇配制成質(zhì)量濃度為10 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。此溶液在4℃保存，可使用6個(gè)月。

標(biāo)準(zhǔn)中間液：取8種吡嗪化合物的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液用純水稀釋為100 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)中間液。標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：取適量標(biāo)準(zhǔn)中間液用水稀釋成適當(dāng)濃度的工作曲線溶液，0～4℃保存。

1.3.2高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜條件

色譜柱：GeminiC6-Pheny1110A苯基柱（250mm×4.6mm，5μm）；柱溫：30℃；流動(dòng)相A：水（含0.1%甲酸溶液+0.1%三氟乙酸溶液），流動(dòng)相B：甲醇，流速：1.0 mL/min；進(jìn)樣量：10 μL；梯度洗脫程序見表1。

表1　流動(dòng)相梯度程序洗脫條件Table 1 Gradient elution conditions of mobile phase

質(zhì)譜條件：電噴霧（e1ectronic sprayion，ESI）離子源；采用負(fù)離子模式；離子監(jiān)測(cè)采用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（mu1tip1e reaction monitoring，MRM）噴霧電壓（spray vo1tage，SV）5 500 V；噴霧氣（GS1）、輔助氣（GS2）、氣簾氣（CUR）流速分別為60 L/h、60 L/h、35 L/h；噴霧器溫度為650℃。定性、定量離子對(duì)、錐孔電壓、碰撞能量等參數(shù)見表2。

表2選擇反應(yīng)監(jiān)測(cè)的優(yōu)化參數(shù)Table 2 Optimized reaction monitoring parameters

1.3.3樣品前處理

酒樣充分振蕩搖勻，過0.22 μm微孔濾膜后直接進(jìn)樣。

2　結(jié)果與分析

2.1檢測(cè)方法的建立

首先通過氣質(zhì)全掃描的方式，采用面積歸一化法初步定量找到了醬香型白酒中含量較高的8種吡嗪化合物，分別是2-甲基吡嗪、2，3-二甲基吡嗪、2，5-二甲吡嗪、2，6-二甲基吡嗪、2，3，5-三甲基吡嗪、2-乙基-6甲基吡嗪、2，3，5，6-四甲基吡嗪、2，3-二甲基-5-乙基吡嗪。隨后對(duì)色譜質(zhì)譜條件及樣品的前處理方法分別進(jìn)行了優(yōu)化，得到滿意的回收率和檢出限，具體優(yōu)化過程可參考文獻(xiàn)［13］，在優(yōu)化后確定的色譜條件下，8種化合物得到很好的分離，其中標(biāo)品的選擇離子流色譜圖見圖1。

圖1　8種吡嗪化合物標(biāo)準(zhǔn)品的MRM色譜圖Fig.1 Multiple reactions monitoring of chromatogram of eight kinds of pyrazines standards

由圖1可知，2，3，5，6-四甲基吡嗪保留時(shí)間為10.96 min、2，3-二甲基-5-乙基吡嗪保留時(shí)間為21.04 min、2，3，5-三甲基吡嗪保留時(shí)間為12.10 min、2-乙基-6甲基吡嗪保留時(shí)間為24.06 min、2，3-二甲基吡嗪保留時(shí)間為12.92 min、2，6-二甲基吡嗪保留時(shí)間為13.53 min、2，5-二甲吡嗪保留時(shí)間為14.87 min、2-甲基吡嗪保留時(shí)間為11.17 min。

2.2醬香型白酒樣品的測(cè)定

方法建立后，用該法對(duì)31個(gè)醬香型代表酒樣中的8種吡嗪化合物進(jìn)行了測(cè)定，測(cè)定結(jié)果見表3。

表3　醬香型白酒中吡嗪化合物的含量Table 3 The contents of pyrazine compounds in Moutai-flavor Baijiu　mg/L

由表3可知，31個(gè)酒樣中2，3，5，6-四甲基吡嗪在21個(gè)酒中含量排第一位，在7個(gè)酒中含量排第二位，在3個(gè)酒中含量排第三位；2，3，5-三甲基吡嗪在18個(gè)酒中含量排第二位，在7個(gè)酒中含量排第一位，在6個(gè)酒中含量排第三位；2，6-二甲基吡嗪排在前三位的占30個(gè)，醬香白酒中2，3，5，6-四甲基吡嗪和2，3，5-三甲基吡嗪是含量較高是醬香型白酒中的表現(xiàn)出來的共性，這也與前期學(xué)者的研究相符合［14-15］。其中茅臺(tái)酒中2，3，5，6-四甲基吡嗪的含量隨著酒度的增高而增大，53%vo1茅臺(tái)酒2，3，5，6-四甲基吡嗪的含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于其他醬香型白酒。

2.3真假茅臺(tái)酒樣品的測(cè)定

將收集的同一規(guī)格的20個(gè)真茅臺(tái)酒和20個(gè)假茅臺(tái)酒進(jìn)行8種吡嗪化合物的測(cè)定，測(cè)定結(jié)果見表4。

由表4可知，20個(gè)假茅臺(tái)酒中2，3，5，6-四甲基吡嗪的含量在0.89～12.5 mg/L，其中有13個(gè)假茅臺(tái)酒中2，3，5，6-四甲基吡嗪含量都＜5 mg/L，而20個(gè)真茅臺(tái)酒中2，3，5，6-四甲基吡嗪的含量在9.25～28.3 mg/L之間，其中有15個(gè)真茅臺(tái)酒中2，3，5，6-四甲基吡嗪含量都＞15 mg/L?？梢酝茰y(cè)2，3，5，6-四甲基吡嗪含量越高，是真茅臺(tái)酒的可能性越大；2，3，5，6-四甲基吡嗪含量越低，是假茅臺(tái)酒的可能性也越大，但這只是一個(gè)推測(cè)，仍需要大量的樣本去驗(yàn)證；從另外其他7種吡嗪的數(shù)據(jù)可以看出，2，3，5-三甲基吡嗪在假茅臺(tái)酒中的含量范圍是0.38～5.25 mg/L，真茅臺(tái)酒中含量范圍是1.29～3.68 mg/L；2-乙基-6-甲基吡嗪在假茅臺(tái)酒中的含量范圍是0.22～7.10 mg/L，真茅臺(tái)酒中含量范圍是0.21～3.19 mg/L；2，6-二甲基吡嗪在假茅臺(tái)酒中的含量范圍是0.22～4.40mg/L，真茅臺(tái)酒中含量范圍是0.18～2.03 mg/L；2，3-二甲基-5-乙基吡嗪在假茅臺(tái)酒中的含量范圍是0.008～1.38 mg/L，真茅臺(tái)酒中含量范圍是0.18～1.15 mg/L；2，3-二甲基吡嗪在假茅臺(tái)酒中的含量范圍是0.08～0.58 mg/L，真茅臺(tái)酒中含量范圍是0.33～0.57 mg/L；2，5-二甲基吡嗪在假茅臺(tái)酒中的含量范圍是0.08～0.56 mg/L，真茅臺(tái)酒中含量范圍是0.12～0.34 mg/L；2-甲基吡嗪在假茅臺(tái)酒中的含量范圍是0.22～7.10 mg/L，真茅臺(tái)酒中含量范圍是0.21～3.19 mg/L。真茅臺(tái)酒中7種吡嗪化合物的含量分布相對(duì)較集中，假茅臺(tái)酒中7中吡嗪化合物的含量分布范圍較寬，其中一些吡嗪化合物的含量高得異常，不在真茅臺(tái)酒數(shù)據(jù)范圍內(nèi)。

表4　真假茅臺(tái)酒中吡嗪化合物的含量Table 4 The content of pyrazine compounds in real and fake Moutai Baijiu　mg/L

因?yàn)闃悠妨坑邢?，只能找出真假茅臺(tái)酒在吡嗪化合物中區(qū)別的一些端倪，最終真假茅臺(tái)酒的鑒別得要通過大量的樣本進(jìn)行數(shù)據(jù)庫(kù)的建立，找到確切的有效的鑒別方法。

3　結(jié)論

本研究建立了醬香型白酒中8種吡嗪化合物的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)法，使白酒中吡嗪化合物的分析不再局限于氣相色譜和氣質(zhì)聯(lián)用，通過建立的方法對(duì)醬香白酒的代表酒樣進(jìn)行了測(cè)定，發(fā)現(xiàn)醬香白酒中2，3，5，6-四甲基吡嗪和2，3，5-三甲基吡嗪是含量較高，同時(shí)嘗試用建立的方法對(duì)真假茅臺(tái)酒中吡嗪化合物進(jìn)行測(cè)定，找到其中一些端倪，為茅臺(tái)酒的真?zhèn)舞b別提供一些思路。

該法靈敏度高，專屬性好，樣品直接進(jìn)樣，在檢測(cè)方法上進(jìn)行了創(chuàng)新，方法的簡(jiǎn)便準(zhǔn)確性適用于大量樣本的測(cè)定，為后期探索醬香白酒中吡嗪類化合物的特征等深入研究奠定技術(shù)基礎(chǔ)。

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Detection of pyrazine compounds in Moutai-f1avor China Baijiu and its characteristics

SUN Di，ZHAO Guibin，YANG Bo
（Guizhou Product Qua1ity Supervision and Inspection Institute，Guiyang 550004，China）

A method for fast quantification of eight pyrazines in China Baijiu（Chinese 1iquor）was estab1ished by HPLC-MS/MS.Eight pyrazine compounds were measured and the characteristics of pyrazine compound in China Baijiu was found.Resu1ts showed that trimethy1 pyrazine and tetramethy1pyazine had higher contents among the eight kinds of pyrazine compounds.At the same time，the eight pyrazine compounds in rea1 and fake Moutai Baijiu samp1es were measured.Resu1ts showed that the tetramethy1pyazine content was much higher than other pyrazine compounds in rea1 Moutai，and the content was 9.25-28.3 mg/L.However，the content tetramethy1pyazine in fake Moutai was 0.89-12.5 mg/L.The method provided reference for Moutai-f1avor Baijiu qua1ity improvement and rea1 and fake Baijiu identification.

HPLC-MS/MS；Moutai-f1avor Baijiu；pyrazines

TS262.33；O657.63

A

0254-5071（2015）12-0162-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2015.12.036

2015-10-26

國(guó)家質(zhì)檢總局科技計(jì)劃項(xiàng)目（2013QK249）

孫棣（1983-），女，高級(jí)工程師，碩士，主要從事食品和酒類分析工作。