尹　佳，王　璐，孫健英，蔡瑩瑩，隋　新*（吉林化工學(xué)院 生物與食品工程學(xué)院，吉林 吉林 132022）

水酶法提取葡萄籽中蛋白質(zhì)工藝的研究

尹佳，王璐，孫健英，蔡瑩瑩，隋新*
（吉林化工學(xué)院 生物與食品工程學(xué)院，吉林 吉林 132022）

采用木瓜蛋白酶對脫脂葡萄籽進(jìn)行酶解提取蛋白質(zhì)。在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，考察酶用量、酶解溫度、pH值、反應(yīng)時(shí)間和料液比對葡萄籽蛋白質(zhì)提取率的影響，采用響應(yīng)面法對葡萄籽蛋白質(zhì)水酶法提取條件進(jìn)行了優(yōu)化。結(jié)果表明，葡萄籽蛋白質(zhì)的最優(yōu)提取條件為：酶解溫度40℃，料液比1∶25（g∶mL），酶用量4%，酶解時(shí)間45 min。在此優(yōu)化條件下，葡萄籽蛋白質(zhì)提取率為67.85%。

水酶法；葡萄籽蛋白質(zhì)；響應(yīng)面法；提取條件

我國是世界上重要的葡萄類產(chǎn)品的生產(chǎn)大國，在生產(chǎn)加工過程中會產(chǎn)生大量的副產(chǎn)物：葡萄籽和葡萄皮。葡萄籽占鮮葡萄質(zhì)量的4%～7%，其含有大量的脂類、蛋白質(zhì)和多酚類物質(zhì)［1-2］。目前，對葡萄籽開發(fā)利用主要集中在葡萄籽油和多酚類物質(zhì)的提取與利用方面，而對葡萄籽蛋白質(zhì)的提取利用方面介紹較少。葡萄籽中粗蛋白的含量達(dá)8.9%，其含有18種氨基酸，包括人體需要的8種必需氨基酸，所以葡萄籽蛋白質(zhì)是優(yōu)質(zhì)的蛋白質(zhì)資源［3］。從1979年以來國外就試著采用各種方法來有效提取葡萄籽蛋白，如傳統(tǒng)的堿溶法、鹽溶法，其研究重點(diǎn)是如何最大限度地提取葡萄籽蛋白而盡量避免蛋白質(zhì)與酚類物質(zhì)結(jié)合，從而造成蛋白顏色深，消化性降低等問題［4-5］。夏輝等［6］采用堿溶酸沉法對脫脂后的葡萄籽蛋白質(zhì)進(jìn)行了提取研究，最大提取率達(dá)到70.6%。吳炳云等［7］采用酶法對葡萄籽中蛋白質(zhì)進(jìn)行提取，提取率可達(dá)89.94%。采用水酶法提取蛋白質(zhì)比常規(guī)方法具有諸多優(yōu)點(diǎn)如反應(yīng)條件溫和、反應(yīng)溫度低、以水為提取溶劑安全高效、提取的蛋白質(zhì)質(zhì)量好、變性程度小、色澤淺等。本研究通過響應(yīng)面法優(yōu)化水酶法提取葡萄籽蛋白質(zhì)工藝，以期為開發(fā)葡萄籽蛋白質(zhì)資源用于生產(chǎn)精蛋白、味精、功能性食品和保健藥品提供參考。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

葡萄籽：產(chǎn)自新疆；木瓜蛋白酶（酶活50萬U/g）、牛血清蛋白、考馬斯亮藍(lán)G-250：北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司。

氫氧化鈉、石油醚（沸程30～60℃）、磷酸一氫鈉、磷酸二氫鈉、磷酸、無水乙醇、濃硫酸、鹽酸均為分析純：上海化學(xué)試劑總廠。

1.2儀器與設(shè)備

HHS電熱恒溫水浴鍋、722可見光分光光度計(jì)：上海精密科學(xué)儀器有限公司；RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：上海金鵬分析儀器有限公司；TGL2050M臺式高速冷凍離心機(jī)：湖南瀘康離心機(jī)有限公司；FA1004A電子分析天平：上海精科天平制造廠；PHS-3CpH計(jì)：上海偉業(yè)儀器廠；S22-2磁力攪拌器：上海司樂儀器有限公司；SKD-200全自動凱氏定氮儀：上海沛歐分析儀器有限公司。

1.3試驗(yàn)方法

1.3.1提取方法

經(jīng)粉碎過60目篩的葡萄籽粉，加入石油醚（料液比1∶25 （g∶mL））于常溫下磁力攪拌脫脂6～8 h，真空抽濾，重復(fù)3次之后合并濾液，真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濾液，干燥得到脫脂葡萄籽粉。稱取1 g脫脂葡萄籽粉按一定比例加入磷酸一氫鈉和磷酸二氫鈉緩沖液，加一定量酶，在一定的溫度、pH值條件下浸提一段時(shí)間后，80℃滅酶10 min，4 000 r/min離心15 min，收集上清液，即為葡萄籽蛋白質(zhì)提取液。將提取液調(diào)節(jié)至蛋白質(zhì)等電點(diǎn)（isoe1ectric point，PI），4 000 r/min離心15min得到沉淀，將沉淀進(jìn)行真空冷凍干燥得到粗蛋白［8-9］。

1.3.2葡萄籽蛋白質(zhì)等電點(diǎn)的測定［10］

用4 mo1/L鹽酸調(diào)節(jié)葡萄籽蛋白質(zhì)提取液的pH值，分別為3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6和4.7，離心分離后將上清液在波長595 nm處進(jìn)行比色測定，吸光度值最小的即為蛋白質(zhì)等電點(diǎn)。

1.3.3蛋白質(zhì)含量的測定

（1）牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作［11］

蛋白質(zhì)含量測定采用考馬斯亮藍(lán)法。牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：取6支15 mL干凈的具塞試管，按表1取樣。蓋塞后，將各個試管中溶液倒轉(zhuǎn)混合，靜置5 min后，在波長595 nm處下測其吸光度值A(chǔ)，記錄各管測定的吸光度值A(chǔ)。

表1　牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線制備Table 1 Standard curve preparation of bovine serum albumin

（2）提取液中蛋白質(zhì)含量的測定

稱取脫脂葡萄籽粉末1 g，按1.3.1操作得到葡萄籽蛋白質(zhì)提取液。取100 μL上清液于具塞比色管中，加入900 μL蒸餾水和5 mL考馬斯亮藍(lán)G-250試劑。蓋塞后，將各試管中溶液倒轉(zhuǎn)混合，放置5 min，在波長595 nm處測其吸光度值A(chǔ)，記錄數(shù)值。以牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程，計(jì)算提取液中蛋白質(zhì)含量。

（3）葡萄籽粉中總蛋白質(zhì)含量的測定［12］

葡萄籽粉中總蛋白質(zhì)含量的測定參照國標(biāo)GB5009.5—2010《食品中蛋白質(zhì)的測定》中的凱氏定氮法。

（4）蛋白質(zhì)提取率的計(jì)算［13］

蛋白質(zhì)提取率的計(jì)算公式如下：

1.3.4單因素試驗(yàn)

以蛋白質(zhì)提取率為評價(jià)指標(biāo)，分別考察酶用量（1%、 2%、3%、4%、5%）、料液比（1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30（g∶mL））、酶解溫度（30℃、35℃、40℃、45℃、50℃）、酶解時(shí)間（30min、35min、40min、45min、55min）及pH值（6.5、7.0、7.5、8.0、8.5）對蛋白質(zhì)提取率的影響。

1.3.5響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)工藝條件

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)，研究酶解溫度（X1）、料液比（X2）、酶用量（X3）、酶解時(shí)間（X4）等因素綜合對葡萄籽蛋白質(zhì)提取率的影響，以葡萄籽蛋白質(zhì)提取率（Y）為響應(yīng)值，確定葡萄籽蛋白質(zhì)的最優(yōu)提取工藝。響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平編碼見表2。

表2響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平Table 2 Factors and levels of response surface experiments

2　結(jié)果與分析

2.1葡萄籽蛋白質(zhì)等電點(diǎn)的測定

葡萄籽蛋白質(zhì)提取液的吸光度值隨pH值變化曲線如圖1所示。由圖1可知，pH值為3.8時(shí)，上清液的吸光度值最小，所以此點(diǎn)即為葡萄籽蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)，即pH=3.8。

圖1　吸光度值隨pH值變化曲線Fig.1 The changes curve of absorbance value with pH

2.2考馬斯亮藍(lán)法測定蛋白質(zhì)含量標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖2　牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 Standard curve of bovine serum albumin

提取液中蛋白質(zhì)含量采用考馬斯亮藍(lán)法測定，以牛血清蛋白質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)，吸光度值（y）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果如圖2所示。

由圖2可知，標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性回歸方程為y=0.000 9x+ 0.005 5，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 7，表明蛋白質(zhì)含量與吸光度值呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

2.3單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.3.1酶用量對葡萄籽蛋白質(zhì)提取率的影響

酶用量對葡萄籽蛋白質(zhì)提取率的影響結(jié)果見圖3。由圖3可知，隨著酶用量的上升，蛋白質(zhì)提取率也隨之提高，當(dāng)酶用量為4%時(shí)，蛋白質(zhì)提取率達(dá)到最大，為54.23%；酶用量＞4%之后，蛋白質(zhì)提取率出現(xiàn)輕微下降。酶用量的增加，提高了蛋白質(zhì)的溶解度。但進(jìn)一步增加酶用量，提取率不會提高，這可能是因?yàn)榈鞍踪|(zhì)受到酶的過度水解，空間結(jié)構(gòu)受到破壞［14］。因此，選取最適酶用量4%為宜。

2.3.2酶解溫度對葡萄籽蛋白質(zhì)提取率的影響

圖3　酶用量對蛋白質(zhì)提取率的影響Fig.3 Effect of enzyme addition on protein extraction rate

酶解溫度對葡萄籽蛋白質(zhì)提取率的影響結(jié)果見圖4。由圖4可知，隨著溫度的上升，蛋白質(zhì)提取率也隨之提高。當(dāng)溫度達(dá)到40℃時(shí)，提取率達(dá)到最大值為55.04%；隨后繼續(xù)升高溫度，蛋白質(zhì)提取率下降。這可能是因?yàn)槊笇Φ孜镒饔迷谧钸m條件下反應(yīng)速率最快，當(dāng)溫度過高時(shí)導(dǎo)致酶失去活性，降低反應(yīng)速率。因此，選取酶解溫度40℃為宜。

圖4　酶解溫度對蛋白質(zhì)提取率的影響Fig.4 Effect of enzymolysis temperature on protein extraction rate

2.3.3料液比對葡萄籽蛋白提取率的影響

料液比對葡萄籽蛋白質(zhì)提取率的影響結(jié)果見圖5。由圖5可知，隨著料液比的增加，蛋白質(zhì)提取率也隨之增加。料液比達(dá)到1∶25（g∶mL）時(shí)提取率最大，此后提取率隨料液比的減小而降低。料液比過小，體系流動性差，酶與底物作用?。涣弦罕冗^大，會使體系中酶濃度降低，降低反應(yīng)速率。因此，選擇最適料液比1∶25（g∶mL）為宜。

2.3.4酶解時(shí)間對葡萄籽蛋白提取率的影響

圖5　料液比對蛋白質(zhì)提取率的影響Fig.5 Effect of solid-liquid ratio on protein extraction rate

酶解時(shí)間對葡萄籽蛋白質(zhì)提取率的影響結(jié)果見圖6。由圖6可知，在35～45 min的反應(yīng)時(shí)間內(nèi)，蛋白質(zhì)提取率增長速率很快；當(dāng)酶解時(shí)間到45 min之后，隨著酶解時(shí)間的延長，蛋白質(zhì)的提取率變化不大。酶解時(shí)間過長會使底物減少，反應(yīng)速率減緩，蛋白質(zhì)發(fā)生變性。因此，酶解時(shí)間選取45 min為宜。

2.3.5pH值對葡萄籽蛋白提取率的影響

圖6　酶解時(shí)間對蛋白質(zhì)提取率的影響Fig.6 Effect of enzymolysis time on protein extraction rate

pH值對葡萄籽蛋白質(zhì)提取率的影響結(jié)果見圖7。由圖7可知，在pH為6.0～7.5范圍內(nèi)，隨著pH值的上升，蛋白質(zhì)提取率增加，在pH值為7.5時(shí)，提取率最高，為44.22%；而在pH值為7.5～8.5的范圍內(nèi)蛋白質(zhì)提取率隨著pH值的升高而降低，這可能是因?yàn)槟竟系鞍酌傅淖钸mpH值為7.0～8.0，超過這個范圍，酶的活性降低，導(dǎo)致提取率下降。因此，選擇最適pH 7.5為宜。

2.4響應(yīng)面法提取條件的優(yōu)化

圖7　pH對蛋白質(zhì)提取率的影響Fig.7 Effect of pH on protein extraction rate

2.4.1響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

根據(jù)響應(yīng)面分析法設(shè)計(jì)原理，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，對葡萄籽中蛋白質(zhì)的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化。固定酶解pH值為7.5，選取酶解時(shí)間（X1）、酶用量（X2）、料液比（X3）、酶解溫度（X4）作為自變量，以葡萄籽蛋白質(zhì)提取率（Y）為響應(yīng)值［15-16］。響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表3。

表3響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 3 Design and results of response surface experiments

采用響應(yīng)面統(tǒng)計(jì)方法對表3試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行多元擬合，建立響應(yīng)面二次回歸模型為：

進(jìn)一步對該回歸模型進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，響應(yīng)面數(shù)據(jù)的方差分析結(jié)果見表4。

表4　回歸模型方差分析Table 4 Variance analysis of regression model

由表4可知，模型P＜0.000 1，說明該模型是極顯著的；失擬項(xiàng)P=0.136 7＞0.05，說明方程具有很好的擬合度；模型R2=0.985 7，說明98.57%的試驗(yàn)數(shù)據(jù)的變異性可用此模型來解釋，因此，可以用該模型對響應(yīng)值進(jìn)行預(yù)測［17］。一次項(xiàng)X3、X4差異極顯著，說明他們對響應(yīng)值的影響極大。由F檢驗(yàn)可得影響因素主次順序?yàn)椋好附鉁囟龋玖弦罕龋久赣昧浚久附鈺r(shí)間。考察因素間的交互作用，酶解時(shí)間和料液比的交互作用與酶用量和料液比的相互作用達(dá)到了顯著。

2.4.2響應(yīng)面分析結(jié)果

通過Design-Expert8.0.6軟件繪制響應(yīng)面及等高線，結(jié)果見圖8。

由圖8可知，料液比和酶解時(shí)間，料液比和酶用量之間的交互作用顯著、影響最大，酶用量和酶解時(shí)間之間，酶解溫度和酶解時(shí)間之間，酶解溫度和酶用量之間，酶解溫度和料液比之間水解度交互作用不顯著。采用響應(yīng)面軟件程序優(yōu)化，得到葡萄籽蛋白質(zhì)提取的最優(yōu)條件為酶解溫度39.69℃，料液比24.52（g∶mL），酶用量4%，酶解時(shí)間45.21min。在此最佳提取條件下，蛋白質(zhì)的提取率為68.07%。

圖8　料液比、酶解時(shí)間、酶解溫度和酶用量交互作用對蛋白質(zhì)提取率影響的響應(yīng)面及等高線Fig.8 Response surfaces plots and contour line of effects of interactions between solid-liquid ratio，enzymolysis time，enzymolysis temperature and enzyme dosage on protein extraction rate

2.4.3驗(yàn)證試驗(yàn)

為檢驗(yàn)響應(yīng)面法所得結(jié)果的可靠性，采用上述優(yōu)化的測定條件進(jìn)行水酶法提取葡萄籽蛋白的試驗(yàn)，考慮到實(shí)際操作情況，將數(shù)值修正為酶解溫度40℃，料液比1∶25 （g∶mL），酶用量4%，反應(yīng)時(shí)間45 min。在此最優(yōu)條件下，進(jìn)行3次平行試驗(yàn)，葡萄籽蛋白質(zhì)提取率的平均值為67.85%，與回歸方程所得的預(yù)測值非常接近，說明該模型能較好地預(yù)測葡萄籽中蛋白質(zhì)的提取率。

3　結(jié)論

選用木瓜蛋白酶提取脫脂葡萄籽粉中的蛋白質(zhì)，在單因素基礎(chǔ)上，通過響應(yīng)面法優(yōu)化蛋白質(zhì)的提取工藝。響應(yīng)面分析結(jié)果顯示，影響蛋白質(zhì)提取率主次因素順序?yàn)椋好附鉁囟龋玖弦罕龋久赣昧浚久附鈺r(shí)間，其最優(yōu)提取條件為：酶解溫度40℃，料液比1∶25（g∶mL），酶用量4%，酶解時(shí)間45 min。在此條件下，葡萄籽蛋白質(zhì)提取率為67.85%。

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Extraction techno1ogy of protein from grape seeds by aqueous enzymatic method

YIN Jia，WANG Lu，SUN Jianying，CAI Yingying，SUI Xin*
（Co11ege of Bio1ogy and Food Engineering，Ji1in Institute of Chemica1 Techno1ogy，Ji1in 132022，China）

Protein was extracted from defatted grape seeds by hydro1ysis of papain.Base on sing1e factor experiments，the effect of enzyme addition，enzymo1ysis temperature，pH，time and so1id-1iquid ratio on grape seed protein extraction rate was investigated.Aqueous enzymatic method extraction conditions of grape seeds protein were optimized by response surface methodo1ogy.Resu1ts indicated that the optimum extraction conditions were as fo11ows:enzymo1ysis temperature 40℃，so1id-1iquid ratio 1∶25（g∶m1），enzyme addition 4%and enzymo1ysis time 45 min.Under this condition，the grape seed protein extraction rate was 67.85%.

aqueous enzymatic method；grape seeds protein；response surface methodo1ogy；extraction conditions

TS261.9

A

0254-5071（2015）12-0122-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2015.12.027

2015-09-08

吉林省大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目（吉教高字［2015］17號）

尹佳（1983-），女，講師，碩士，研究方向?yàn)槭称飞锛夹g(shù)與功能性食品。

隋新（1972-），男，副教授，碩士，研究方向?yàn)槭称飞锛夹g(shù)與功能性食品。