郭　芳，方　婷，陳錦權(quán)（.呂梁學(xué)院 生命科學(xué)系，山西 呂梁 033000；.福建農(nóng)林大學(xué) 食品科學(xué)學(xué)院，福建 福州 35000）

鮑魚臟器酶解工藝條件的優(yōu)化

郭芳1，方婷2，陳錦權(quán)2
（1.呂梁學(xué)院 生命科學(xué)系，山西 呂梁 033000；2.福建農(nóng)林大學(xué) 食品科學(xué)學(xué)院，福建 福州 350002）

以鮑魚內(nèi)臟為原料，采用堿性蛋白酶水解鮑魚內(nèi)臟制備血管緊張素轉(zhuǎn)換酶（ACE）抑制肽。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)

面法和Box-Behnken試驗(yàn)優(yōu)化酶解鮑魚內(nèi)臟的工藝條件。以ACE抑制率為考察指標(biāo)，探討了酶解溫度、加酶量和酶解時(shí)間對(duì)ACE抑制率的影響。試驗(yàn)結(jié)果表明，最優(yōu)工藝條件為酶解溫度52℃，pH 9.0，料液比1∶3（g∶mL），加酶量4.5%，酶解時(shí)間5.5 h，此條件下獲得的鮑魚內(nèi)臟酶解產(chǎn)物的ACE抑制率為79.72%。

鮑魚內(nèi)臟；酶解；ACE抑制率；響應(yīng)面法

血管緊張素轉(zhuǎn)化酶（angiotensin converting enzyme，ACE）對(duì)人體內(nèi)血壓調(diào)節(jié)起關(guān)鍵作用［1］。降壓肽即ACE抑制肽，是一類ACE抑制劑。降壓肽通過抑制ACE的活性，抑制具有升高血壓作用的血管緊張素II的生成，同時(shí)阻礙能降低血壓的血管舒緩激肽的分解，從而使血壓降低［2］。其中，由食源性蛋白制備的降血壓肽因其無毒副作用、安全性高，且對(duì)血壓正常者不產(chǎn)生降壓效果［3］，適宜長(zhǎng)期食用，已經(jīng)成為當(dāng)前研究的熱點(diǎn)。

有關(guān)資料顯示，已從大豆、牛奶、乳酪、魚類、藻類和貝類等食物的蛋白質(zhì)酶解產(chǎn)物中分離出ACE抑制活性比較高的降血壓活性肽［4-17］；據(jù)有關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，從魚、蝦、蟹等水產(chǎn)類動(dòng)物蛋白中酶解制備的降壓肽，其降壓活性要優(yōu)于其他食源性蛋白［18］。但鮮見鮑魚內(nèi)臟蛋白制備降血壓肽的報(bào)道。隨著鮑魚養(yǎng)殖業(yè)、加工業(yè)的迅速發(fā)展，大量的鮑魚臟器被當(dāng)作加工廢棄物而堆積起來，極容易變質(zhì)腐爛，造成了相當(dāng)大的經(jīng)濟(jì)損失，同時(shí)也會(huì)帶來環(huán)境污染的問題。本實(shí)驗(yàn)以鮑魚內(nèi)臟為原料，利用在CUSHMAN D W等［19］體外測(cè)定方法基礎(chǔ)上的改進(jìn)方法［13］，測(cè)定鮑魚臟器蛋白酶解產(chǎn)物的ACE抑制活性，擬為后續(xù)的分離純化鮑魚內(nèi)臟降血壓肽提供理論基礎(chǔ)。本研究為鮑魚資源的綜合利用提供了依據(jù)，并為天然降血壓保健品的開發(fā)和研究提供試驗(yàn)數(shù)據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

鮑魚臟器：漳州歐圣食品有限公司；食用酒精：福州南港食品添加劑有限公司；A1ca1ase堿性內(nèi)切蛋白酶：丹麥諾維信公司；馬尿酰-組氨酰-亮氨酸（N-Hippury1-His-Leu hydrate，HHL）、血管緊張素轉(zhuǎn)化酶（ACE）：美國(guó)Sigma公司；馬尿酸標(biāo)準(zhǔn)品：中國(guó)藥品生物制品檢定所；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2儀器與設(shè)備

L-550大容量離心機(jī)：長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司；HT-2A雙頭磁力加熱攪拌器：常州國(guó)華電器有限公司；HWS-28電熱恒溫水浴鍋：上海一恒科技有限公司；UV6300PC紫外可見光分光光度計(jì)：上海美譜達(dá)儀器有限公司；R205旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：上海申生科技有限公司；MJ-60B01A攪拌機(jī)：廣東美的精品電器制造有限公司；SJ-3F pH計(jì)：上海精密科學(xué)儀器有限公司；高壓脈沖電場(chǎng)設(shè)備：食品工程試驗(yàn)室自制。

1.3方法

1.3.1原料前處理

鮑魚內(nèi)臟→去結(jié)締組織→加2倍質(zhì)量的水打漿→過60目篩→膠體磨處理→高壓脈沖電場(chǎng)處理→離心（3 500 r/min、20 min）→去上清，取沉淀→加食用酒精（體積分?jǐn)?shù)75%）攪拌2 h→離心（3 500 r/min、15 min）→去上清，取沉淀→酒精脫色處理重復(fù)2次→蛋白沉淀復(fù)溶并進(jìn)行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)→脫去酒精→得到的蛋白液，凍藏備用。

1.3.2酶解試驗(yàn)

將預(yù)處理液解凍，按1∶5（g∶mL）的比例加水調(diào)漿，根據(jù)要求調(diào)節(jié)勻漿的pH及反應(yīng)溫度，按料液比1∶3（g∶mL）加入堿性蛋白酶進(jìn)行酶解反應(yīng)，完成后在100℃條件下加熱15 min滅酶，4 000 r/min離心15 min后收集上清液。

1.3.3ACE抑制活性的檢測(cè)

ACE抑制率：按照參考文獻(xiàn)［19］的方法計(jì)算。

1.3.4鮑魚臟器蛋白酶解單因素試驗(yàn)

以ACE抑制率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，分別考察酶解溫度、pH值、加酶量及酶解時(shí)間等條件對(duì)鮑魚臟器蛋白酶解液降壓活性的影響。

1.3.5鮑魚臟器蛋白酶解響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用三元二次通用旋轉(zhuǎn)組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)與響應(yīng)面分析法，探討酶解溫度（A）、酶解時(shí)間（B）、加酶量（C）及其交互作用對(duì)酶解液ACE抑制率的影響，并建立各因素與ACE抑制率間的數(shù)學(xué)模型。響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平見表1。

表1響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface design

2　結(jié)果與分析

2.1單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1酶解溫度對(duì)鮑魚臟器酶解產(chǎn)物ACE抑制率的影響

在pH 9.0，料液比1∶3（g∶mL），加酶量5%的條件下，分別在30℃、40℃、50℃、60℃、70℃酶解4h，考察酶解溫度對(duì)鮑魚臟器酶解產(chǎn)物ACE抑制率的影響，結(jié)果如圖1所示。

由圖1可知，所得酶解液的ACE抑制活性隨著溫度的增加呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，酶解物ACE抑制率在30～50℃升高較快；在50℃時(shí)酶解物ACE抑制率達(dá)到峰值，為78.16%；在50～70℃下降緩慢，這是由于酶活受溫度的影響造成的［20］。所以選擇最適的酶解溫度為50℃。

圖1　酶解溫度對(duì)鮑魚臟器酶解產(chǎn)物ACE抑制率的影響Fig.1 Effect of hydrolysis temperature on the ACE inhibitory rate of abalone viscera hydrolysate

2.1.2pH對(duì)鮑魚臟器酶解產(chǎn)物ACE抑制率的影響

在溫度為50℃，料液比1∶3（g∶mL），加酶量5%的條件下，分別控制水解液的pH值為8.0、8.5、9.0、9.5、10.0酶解4 h，考察pH對(duì)鮑魚臟器酶解產(chǎn)物ACE抑制率的影響，結(jié)果如圖2所示。

圖2　pH對(duì)鮑魚臟器酶解產(chǎn)物ACE抑制率的影響Fig.2 Effect of pH on the ACE inhibitory rate of abalone viscera hydrolysate

由圖2可知，在pH 8.0～10.0的范圍內(nèi)，pH對(duì)酶解液ACE抑制率的影響不大。當(dāng)pH在8.0～9.0的范圍內(nèi)，ACE抑制率隨著pH的增大而增大；當(dāng)pH為9.0時(shí)，ACE抑制率達(dá)到最大值，為75.95%；pH＞9.0時(shí)，ACE抑制率隨著pH的升高而降低。說明此條件下鮑魚臟器蛋白液酶解產(chǎn)物的降壓活性最高，所以選擇最適pH值為9.0。

2.1.3加酶量對(duì)鮑魚臟器酶解產(chǎn)物ACE抑制率的影響

在酶解溫度50℃，料液比1∶3（g∶mL），pH 9.0，酶解時(shí)間4 h的條件下，分別控制加酶量為1%、3%、5%、7%、9%，考察加酶量對(duì)鮑魚臟器酶解產(chǎn)物ACE抑制率的影響，結(jié)果如圖3所示。

由圖3可知，鮑魚臟器蛋白酶解液的ACE抑制率隨著酶添加量的增加而上升，提高速率開始時(shí)候比較大，當(dāng)加酶量為5%時(shí)，ACE抑制率為75.93%；當(dāng)加酶量＞5%時(shí)，ACE抑制率逐漸降低，最后曲線趨于平緩。綜合節(jié)約成本的考慮，加酶量選擇為5%比較合適。

圖3　加酶量對(duì)鮑魚臟器酶解產(chǎn)物ACE抑制率的影響Fig.3 Effect of enzyme addition on the ACE inhibitory rate of abalone viscera hydrolysate

2.1.4酶解時(shí)間對(duì)鮑魚臟器酶解產(chǎn)物ACE的影響

在酶解溫度50℃，料液比1∶3（g∶mL），加酶量5%，pH 9.0的條件下，將鮑魚臟器蛋白液進(jìn)行水解，每隔1h取樣測(cè)定，考察時(shí)間對(duì)鮑魚臟器酶解產(chǎn)物ACE的影響，結(jié)果如圖4所示。

圖4　酶解時(shí)間對(duì)鮑魚臟器酶解產(chǎn)物ACE的影響Fig.4 Effect of hydrolysis time on the ACE inhibitory rate of abalone viscera hydrolysate

由圖4可知，隨著反應(yīng)時(shí)間延長(zhǎng)，酶解產(chǎn)物的ACE抑制率呈先急速升高后又緩慢下降的趨勢(shì)，在酶解時(shí)間為5 h時(shí)，ACE抑制率達(dá)到峰值，為76.14%；酶解時(shí)間達(dá)到5 h后，ACE抑制率緩慢下降。這可能是在酶解反應(yīng)初期，底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)高，水解速率大，降壓活性短肽產(chǎn)生較快；隨著反應(yīng)的進(jìn)行，底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)降低，酶解速率下降，同時(shí)部分的短肽片段進(jìn)一步被水解，從而導(dǎo)致降壓活性下降；而且隨著時(shí)間的積累，蛋白酶發(fā)生變性也會(huì)對(duì)酶解反應(yīng)造成極大的影響［21］。因此，酶解時(shí)間5 h為宜。

2.2響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果與分析

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選擇溫度（A）、時(shí)間（B）、加酶量（C）為3個(gè)因素，以ACE抑制率（Y）為響應(yīng)值，進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果與分析見表2，得到回歸模型參數(shù)的方差分析見表3。

表2　鮑魚臟器蛋白酶解響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果與分析Table 2 Design and results of response surface experiments

表3　回歸模型方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

從方差分析（表3）可以看出，F(xiàn)失擬=1.39，對(duì)應(yīng)的P＞0.1，失擬效果不顯著，說明本模型擬合性好；F模型=5.67，對(duì)應(yīng)的P＜0.05，說明本模型顯著。此模型中顯著項(xiàng)為B、A2、B2、C2。比較溫度、時(shí)間、加酶量3因素的F值可得出：在酶解試驗(yàn)中，時(shí)間的影響最大，其次為加酶量，溫度的影響為最小。

使用Design-Expert 8.0軟件對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，建立溫度、時(shí)間、加酶量與ACE抑制率之間的數(shù)學(xué)回歸模型，得到編碼的回歸方程如下：

根據(jù)后歸分析結(jié)果作響應(yīng)面及等高線圖，結(jié)果見圖5。圖中分別表示當(dāng)酶解溫度、酶解時(shí)間、加酶量中任意一個(gè)變量取0水平時(shí)，其余兩個(gè)變量的交互作用對(duì)ACE抑制率的影響。從圖5可以看出，任意兩個(gè)因素間都存在較明顯的交互作用，最佳點(diǎn)在試驗(yàn)考察的范圍內(nèi)。

利用Design Expert-8.0軟件優(yōu)化組合工藝參數(shù)，得到酶解鮑魚臟器蛋白的最佳工藝條件為酶解溫度51.8℃、酶解pH 9.0、料液比1∶3（g∶mL）、加酶量4.46%、酶解時(shí)間5.53 h。為便于操作，修改試驗(yàn)條件為酶解溫度52℃，pH 9.0，料液比1∶3（g∶mL），加酶量4.5%，酶解時(shí)間5.5 h，對(duì)優(yōu)化的結(jié)果重新進(jìn)行試驗(yàn)，測(cè)得的ACE抑制率實(shí)際值為79.72%，與預(yù)測(cè)值79.78%基本吻合，驗(yàn)證了回歸方程的準(zhǔn)確性，證明了該試驗(yàn)設(shè)計(jì)及分析方法較為可靠。

3　結(jié)論

本試驗(yàn)采用堿性蛋白酶水解鮑魚臟器蛋白制備ACE抑制肽，以ACE抑制率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，利用響應(yīng)面法探討了最優(yōu)的酶解工藝，結(jié)果表明，制備ACE抑制肽的最佳工藝參數(shù)為酶解溫度52℃，pH 9.0，料液比1∶3（g∶mL），加酶量4.5%，酶解時(shí)間5.5 h。對(duì)優(yōu)化的結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，酶解液的ACE抑制率為79.72%。但只是得到了鮑魚臟器蛋白ACE抑制肽的初產(chǎn)物，后續(xù)的分離、純化及其結(jié)構(gòu)鑒定還需進(jìn)一步的進(jìn)行研究。

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Optimization of hydro1ysis techno1ogy of aba1one viscera

GUO Fang1，F(xiàn)ANG Ting2，CHEN Jinquan2
（1.Department of Life Science，Lü Liang University，Lü1iang 033000，China；
2.Co11ege of Food Science，F(xiàn)ujian Agricu1ture and Forestry University，F(xiàn)uzhou 350002，China）

Using aba1one viscera as raw materia1，the ACE inhibitory peptide was prepared by a1ka1ine proteinse hydro1ysis.Based on sing1e factor experiments，response surface methodo1ogy and Box-Behnken experiments were emp1oyed to optimize the hydro1ysis process of aba1one viscera.Using ACE inhibitoryrate aseva1uation index，the effectofhydro1ysistemperature，time and enzyme addition on ACE inhibitoryrate was investigated.Resu1ts indicated that the optima1 process was hydro1ysis temperature 52℃，pH 9.0，so1id-1iquid ratio 1∶3（g∶m1），enzyme addition 4.5%and hydro1ysis time 5.5 h.Under these conditions，the ACE inhibitory rate of protein hydro1ysis product from aba1one viscera was 79.72%.

aba1one viscera；enzymatic hydro1ysis；ACE inhibitory rate；response surface methodo1ogy

TS254.9；Q556.3

A

0254-5071（2015）12-0101-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2015.12.022

2015-09-24

閩發(fā)改投資項(xiàng)目（［2014］168號(hào)）

郭芳（1985-），女，助教，碩士，研究方向?yàn)槭称芳庸ぜ夹g(shù)。