王曉琴，張小花，安　玲，朱珍珍，曹　禮*（.河西學院 農(nóng)業(yè)與生物技術學院，甘肅 張掖 734000；2.河西學院 甘肅省河西走廊特色資源利用重點實驗室，甘肅 張掖 734000）

一株放線菌菌株HDF-1的分離、鑒定及抑菌活性研究

王曉琴1，2，張小花1，安玲1，朱珍珍1，曹禮1，2*
（1.河西學院 農(nóng)業(yè)與生物技術學院，甘肅 張掖 734000；
2.河西學院 甘肅省河西走廊特色資源利用重點實驗室，甘肅 張掖 734000）

從黑河濕地土壤樣品中分離得到一株中度嗜堿放線菌HDF-1，適宜生長pH值為8～10，培養(yǎng)時可以向細胞外分泌蛋白酶、淀粉酶，不能分解含硫氨基酸產(chǎn)生硫化氫，不能產(chǎn)生胞外纖維素酶。菌株HDF-1能夠利用葡萄糖、果糖、蔗糖以及麥芽糖作為碳源；該菌株代謝產(chǎn)物中含有抑制金黃色葡萄球菌（Staphy1ococcus aureus）的活性物質，抑菌圈直徑達到了15.2 mm，而對黑曲霉（Aspergi11us niger）、青霉（Penici11ium chrysogenum）和大腸桿菌（Escherichia co1i）的生長沒有抑制作用。根據(jù)菌株HDF-1的形態(tài)特征、生理生化特征及其16S rRNA系統(tǒng)進化分析，將該菌株鑒定為鏈霉菌屬（Streptomycessp.）。

濕地；放線菌；鑒定；抑菌活性

濕地是分布于陸地生態(tài)系統(tǒng)和水生生態(tài)系統(tǒng)之間具有獨特水文、土壤、植被與生物特征的生態(tài)系統(tǒng)，全球約5%～8%的地球陸地表面被濕地覆蓋［1-2］。濕地具有獨特的生態(tài)結構和功能，富有生物多樣性，是人類最重要的生存環(huán)境之一，在涵養(yǎng)水源、調(diào)節(jié)氣候、凈化水質、防風固沙、減輕沙塵暴危害、阻止沙漠侵蝕，維護區(qū)域生態(tài)安全等方面發(fā)揮重要作用［3-4］。

微生物作為濕地生態(tài)系統(tǒng)的主體和核心，在物質的礦化、硝化、反硝化等過程中起到關鍵作用［5-7］。微生物種群結構的多樣性、穩(wěn)定性和種群恢復性在維護濕地生態(tài)系統(tǒng)的有效性中起著關鍵作用［8-9］。通過分離、純化濕地環(huán)境樣品中的微生物群，利用其生物作用提高濕地土壤質地、改善濕地土壤生態(tài)環(huán)境、增強土壤酶活力、保護和恢復濕地資源與環(huán)境，就顯得尤為重要。

本研究從黑河濕地得到一株中度嗜堿放線菌HDF-1，研究其形態(tài)特征、生理生化特征和16S rRNA序列，并研究其抑菌活性，以期通過濕地微生物的研究為改善和恢復黑河濕地土壤生態(tài)環(huán)境、提高土壤質地、增強土壤酶活力，為保護濕地生態(tài)系統(tǒng)提供基礎。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

1.1.1分離材料與試驗菌株

土壤樣品采自張掖國家級濕地公園；金黃色葡萄球菌（Staphy1ococcus aureus）、黑曲霉（Aspergi11us niger）、青霉（Penici11ium chrysogenum）和大腸桿菌（Escherichia co1i）均為實驗室保存。

1.1.2培養(yǎng)基

高氏一號培養(yǎng)基：可溶性淀粉20.0 g、硝酸鉀1.0 g、氯化鈉0.5 g、磷酸氫二鉀0.5 g、硫酸鎂0.5 g、硫酸亞鐵0.01 g、瓊脂20.0 g、蒸餾水1 000 mL，pH 7.2～7.4。無碳源基礎培養(yǎng)基：硫酸銨2.64 g、磷酸二氫鉀2.38 g、磷酸氫二鉀5.65 g、硫酸鎂1.0 g、硫酸銅0.006 4 g、硫酸亞鐵0.001 1 g、氯化錳0.0079g、硫酸鋅0.0015g、蒸餾水1000mL，pH值為7.2～7.4。

無氮源基礎培養(yǎng)基：葡萄糖10.0 g、磷酸二氫鉀2.38 g、磷酸氫二鉀5.65 g、硫酸鎂1.0 g、硫酸銅0.006 4 g、硫酸亞鐵0.001 1 g、氯化錳0.007 9 g、硫酸鋅0.001 5 g、蒸餾水1 000 mL，pH為7.2～7.4。固體培養(yǎng)基在上述培養(yǎng)基的基礎上加入15 g/L的瓊脂。

1.1.3化學試劑

分子操作中所用的酶、抗生素和載體pMD19-T均購自大連寶生物工程有限公司；DNA凝膠回收試劑盒購自Axygen公司；PCR引物由上海生工生物工程有限公司合成，其余試劑為國產(chǎn)分析純。

1.2儀器與設備

DPX-9272B-1電熱恒溫培養(yǎng)箱：上海?，攲嶒炘O備有限公司；YXQ-LS-50SII立式壓力蒸汽滅菌器：上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠；HZQ-X400恒溫振蕩培養(yǎng)箱：太倉市華美生化儀器廠；LRH-250-Z振蕩培養(yǎng)箱：廣東省醫(yī)療器械廠；B-260恒溫水浴鍋：上海亞榮生化儀器廠；SWCJ-1型超凈工作臺：蘇州凈化設備；Cyc1er PCR儀：美國ABI公司；TGL-16G離心機：上海安亭科學儀器廠；DYCP-31DN型電泳儀：北京市六一儀器廠。

1.3方法

1.3.1樣品的采集與處理

從張掖國家級濕地公園的不同位置取樣，將土樣均勻混合并裝在預先滅菌的三角瓶中，密封。取混勻后的土樣10 g，放入盛90 mL無菌水并帶玻璃珠的三角瓶中，28℃振蕩30 min，使土樣與水充分混合，將微生物分散。取適量樣品懸液連續(xù)稀釋涂布于含3%重鉻酸鉀的高氏一號培養(yǎng)基上，于28℃恒溫培養(yǎng)一周左右，然后挑取單菌落，在高氏一號培養(yǎng)基培養(yǎng)，經(jīng)連續(xù)分離純化后，得到純化的菌株，命名為HDF-1，將純化的菌落轉至斜面，4℃條件保存。

1.3.2菌株HDF-1的形態(tài)特征

采用插片法將菌株HDF-1接種于高氏一號培養(yǎng)基平板上，于28℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)6～15 d，觀察細菌生長情況及菌落特征，借助插片法經(jīng)0.1%美藍染色后在光學顯微鏡下觀察形態(tài)學特征［10］。

1.3.3菌株HDF-1的生理生化特征鑒定

菌株HDF-1的部分生理生化特征鑒定參考《放線菌快速鑒定與系統(tǒng)分類》進行［11］。

1.3.4菌株HDF-1的16S rDNA擴增和序列測定

以菌株HDF-1的總DNA為模板，使用通用引物來擴增菌株HDF-1的基因［12］。5’端引物為5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’（Escherichia co1ibases 8-27），3’端引物為5’-TACCTTGTTACGACTT-3’（E.co1ibase 1507-1492）。50 μL的反應體系：10×buffer 5.0 μL，氯化鎂（25 mmo1/L）4.0 μL，脫氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonuc1eoside triphosphate，dNTP）（2.5 mmo1/L）4.0 μL，模板DNA（50.0 ng/μL）1.0 μL，引物1（1 mmo1/L）1.0 μL，引物2（1 mmo1/L）1.0 μL，rTaq酶（5.0 U/μL）1.0 μL，超純水33.5 μL。聚合酶鏈反應（po1ymerase chain reaction，PCR）擴增條件為：94℃預變性2 min，進入熱循環(huán)；94℃變性30 s，52℃退火30 s，72℃延伸1.5min。擴增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。16SrDNA序列測定由上海生工生物工程有限公司完成。

1.3.5菌株HDF-1抑菌實驗

將菌株HDF-1接種于高氏一號培養(yǎng)基上，采用濾紙片法測定菌株HDF-1的抑菌活性，在濾紙上分別接種于金黃色葡萄球菌（Staphy1ococcus aureusW18）、大腸桿菌（Escherichia co1iW06-1）、黑曲霉（Aspergi11us nigerYY-12）、青霉（Penici11ium chrysogenumPTY-1），于28℃恒溫箱倒置培養(yǎng)6～15 d，取出觀察，記錄抑菌圈直徑大小。

2　結果與分析

2.1菌株HDF-1的形態(tài)特征

經(jīng)過連續(xù)的分離與純化，從黑河濕地樣品中得到一株放線菌菌株，命名為HDF-1。該菌株在高氏一號培養(yǎng)基中28℃劃線培養(yǎng)5 d后其菌落形態(tài)特征結果如圖1所示。

圖1　菌株HDF-1在高氏一號培養(yǎng)基上不同時間的生長狀況Fig.1 The growth of strain HDF-1 in Gause'sⅠmedium at different time

由圖1A可知，菌落呈淡黃色，不透明，表面光滑，繼續(xù)培養(yǎng)菌落呈絨狀或顆粒狀，干燥，不易挑起；培養(yǎng)7 d后，如圖1B所示，菌落呈乳白色，不透明，表面呈絨狀或毛狀，干燥，易挑起；培養(yǎng)9 d后，如圖1C所示，菌落逐漸呈灰紫色，表面產(chǎn)生細微的水珠，潮濕，易挑起；培養(yǎng)15 d后，如圖1D所示，菌落呈灰紫色，表面干燥，呈絨狀或粉狀，易挑起。

借助插片法經(jīng)0.1%美藍染色后在光學顯微鏡下觀察，菌株HDF-1菌絲及孢子形態(tài)學特征見圖2。

圖2　放線菌菌株HDF-1的菌絲形態(tài)及孢子形態(tài)Fig.2 Mycelium and spore morphology of actinomycetes HDF-1

由圖2可知，菌絲有大量分支，不斷裂，氣生菌絲分化成柔曲狀孢子絲，孢子呈圓形，表面光滑。

2.2菌株HDF-1的生理生化特性

表1　菌株HDF-1的部分生理生化特征Table 1 Part physiological and biochemical characteristics of strain HDF-1

菌株的部分生理生化特征如表1所示。由表1可知，在供試的幾種碳源中，該菌株對葡萄糖、果糖、蔗糖和麥芽糖利用較好，其中對葡萄糖利用最好，而對乳糖、木糖、阿拉伯糖、糊精則不能利用。在供試的幾種氮源中，該菌株對硝酸鉀、硝酸銨、硫酸銨、尿素和蛋白胨利用較好，其中對硝酸銨和蛋白胨利用最好，而對硝酸鈉、草酸銨、酵母粉和玉米粉不能利用；菌株HDF-1可以產(chǎn)生黑色素、可以液化明膠、在過氧化氫酶和試驗中呈陽性，可以水解淀粉，但不能產(chǎn)H2S，不能降解纖維素、牛奶胨化實驗呈陰性。菌株HDF-1在pH值為8～10時生長良好，pH值為10時長勢最好；最適生長溫度為28℃。

2.3菌株HDF-1基因組的提取及擴增

以分離篩選所獲得的菌株HDF-1的基因組DNA為模板進行PCR擴增，結果見圖3。由圖3可知，基因組DNA在電泳圖上的23 130 bp附近一條明顯的條帶，PCR擴增后得到長約1.5 kb的片段，證明PCR擴增成功。將純化后的PCR產(chǎn)物連接到載體pMD19-T上，轉化至大腸桿菌中，送樣測序。

2.4放線菌菌株HDF-1的系統(tǒng)進化分析

圖4　菌株HDF-1的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Phylogenetic tree of strain HDF-1

根據(jù)16SrRNA基因的測序結果，將其序列與EzTaxon-e server（http：//eztaxon-e.ezbioc1oud.net/）數(shù)據(jù)庫中16S rRNA基因序列進行同源性比較［13］，采用CLUSTAL_X將菌株HDF-1的16S rRNA基因序列與其同源關系相近序列比對分析后［14］，用MEGA version 5.0軟件轉換格式后，采用鄰近法構建系統(tǒng)進化樹［15］，結果如圖4所示。由圖4可知，菌株HDF-1與菌株纖維黃鏈霉菌NBRC 13780（Streptomyces ce11u1of1avusNBRC 13780）和白長鏈霉菌NBRC 13465 （Streptomyces a1bo1ongusNBRC 13465）有最大的序列相似性，皆為99.04%。結合菌株HDF-1的形態(tài)特征、生理生化特性及其16S rDNA系統(tǒng)進化分析，將分離所得菌株HDF-1鑒定為鏈霉菌（Streptomycessp.）。

2.5菌株HDF-1的抑菌實驗

采用濾紙片法檢測放線菌菌株HDF-1是否具有抑菌作用，結果如表2所示。由表2可知，放線菌菌株HDF-1對大腸桿菌、黑曲霉和青霉則無抑菌作用；對金黃色葡萄球菌有明顯抑菌作用，抑菌圈直徑在第6天時達到15.20 mm，培養(yǎng)到第9天抑菌圈直徑減小至11.46 mm。這可能是由于隨著培養(yǎng)時間的延長，前體物質耗盡或者次級代謝產(chǎn)物積累引起自身反饋調(diào)節(jié)，導致抑菌活性物質產(chǎn)量降低，從而導致第9天時抑菌圈直徑小于第6天。一般認為，抑菌圈直徑達到10 mm以上，即具有了較強的抑菌性［16］。

表2　菌株HDF-1的抑菌效果Table 2 Antibacterial effect of strain HDF-1

3　結論

本研究經(jīng)過分離與純化，從張掖黑河濕地的樣品中得到一株放線菌菌株HDF-1。該菌株的菌落呈放射狀生長，在高氏一號液體培養(yǎng)基中氣生菌絲呈金黃色，單個孢子呈球形；氣生菌絲體覆蓋在菌落邊緣，形成毛狀邊緣，成熟的菌落呈灰紫色，孢子絲形狀為柔曲狀。

該菌株HDF-1是一株中度嗜堿的放線菌，生長pH值為7～11，最適生長pH值為10，可以向細胞外分泌蛋白酶、淀粉酶，不能產(chǎn)生纖維素酶，不能分解含硫氨基酸產(chǎn)生硫化氫，能夠利用葡萄糖、果糖、蔗糖和麥芽糖作為碳源。結合菌株HDF-1的形態(tài)特征、生理生化特性及其16S rDNA系統(tǒng)進化分析，將分離所得菌株HDF-1鑒定為鏈霉菌（Streptomycessp.）。菌株HDF-1的代謝產(chǎn)物對金黃色葡萄球菌有明顯抑菌作用，抑菌圈直徑在第6天時達到15.20 mm，對大腸桿菌、黑曲霉和青霉則無抑菌作用，在保護濕地生態(tài)系統(tǒng)中，該菌株具有潛在的應用前景。

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Iso1ation，identification and the antimicrobia1 activity of an actinomycetes strain HDF-1

WANG Xiaoqin1，2，ZHANG Xiaohua1，AN Ling1，ZHU Zhenzhen1，CAO Li1，2*
（1.Co11ege of Agricu1ture and Biotechno1ogy，Hexi University，Zhangye 734000，China；
2.Key Laboratory of Hexi Corridor Resourses Uti1ization of Gansu，Hexi University，Zhangye 734000，China）

A moderate1y basophi1ic actinomycetes HDF-1 was iso1ated from soi1 samp1e of Heihe wet1and.The suitab1e pH for growth was 8-10.The strain HDF-1 cou1d secrete protease and amy1ase，cou1d not break down the su1fur amino acid to produce hydrogen su1fide，and cou1d not produce extrace11u1ar ce11u1ose.Strain HDF-1 cou1d uti1ize g1ucose，fructose，sucrose and ma1tose as carbon source.The metabo1ites of strain HDF-1 contained active substances that cou1d inhibitStaphy1ococcus aureus，and the diameter of antibacteria1 circ1e reached to 15.2 mm，whi1e it had no inhibitory effect onAspergi11us niger，Penici11ium chrysogenumandEscherichia co1i.By the morpho1ogica1 characteristics，the physio1ogica1 and biochemica1 characteristics and the phy1ogenetic ana1ysis of the 16S rRNA gene，the strain HDF-1 was identified asStreptomycessp.

wet1and；actinomycetes；characterization；antimicrobia1 activity

Q93

A

0254-5071（2015）12-0044-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2015.12.010

2015-10-28

河西走廊特色資源利用重點實驗室項目（No.XZ1401）

王曉琴（1964-），女，高級實驗師，本科，研究方向為應用微生物學。

曹禮（1977-），男，副教授，博士，研究方向為環(huán)境微生物學。