蔣國(guó)君 李利 吳小祥 董淑英 童旭輝

肺癌是嚴(yán)重威脅人類(lèi)健康的惡性腫瘤之一，以順鉑為基礎(chǔ)的聯(lián)合化療是常見(jiàn)的晚期肺癌化療方案，但是連續(xù)、大量使用不僅會(huì)出現(xiàn)嚴(yán)重的不良反應(yīng)，還會(huì)使腫瘤細(xì)胞對(duì)順鉑敏感性降低，從而導(dǎo)致化療失敗。因此尋找增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對(duì)順鉑敏感性的方法對(duì)于逆轉(zhuǎn)細(xì)胞耐藥、擴(kuò)大其臨床應(yīng)用至關(guān)重要。

縫隙連接（gap junction, GJ）是細(xì)胞間物質(zhì)交換的重要蛋白通道，由連接蛋白（connexin, Cx）組成，廣泛存在于實(shí)質(zhì)性臟器中，如肺臟、肝臟等。近年來(lái)研究[1]顯示GJ在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移過(guò)程中起到非常重要的作用，且本課題組前期研究[2-4]表明，通過(guò)采用GJ功能工具藥物調(diào)控細(xì)胞GJ功能能夠增加鉑類(lèi)藥物的抗腫瘤活性。

黃連素（berberine, BBR）又名小檗堿，是從中國(guó)傳統(tǒng)中藥黃連的根、莖中提煉出的主要成分，廣泛用于治療感染性腹瀉、細(xì)菌性痢疾等感染性腸道疾病。Liu等[5]證明了黃連素可以通過(guò)調(diào)控腫瘤細(xì)胞GJ功能進(jìn)而增強(qiáng)X射線(xiàn)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用，但是具體機(jī)理不明。因此本實(shí)驗(yàn)通過(guò)聯(lián)合應(yīng)用黃連素和順鉑，觀(guān)察他們對(duì)肺癌細(xì)胞的殺傷作用，并對(duì)相關(guān)機(jī)制進(jìn)行探討。

1 材料與方法

1.1 材料 肺癌細(xì)胞A549購(gòu)自于ATCC公司，由蚌埠醫(yī)學(xué)院藥理實(shí)驗(yàn)室凍存。順鉑、黃連素、GF109203X、胰蛋白酶、MTT、二甲基亞砜（DMSO）均為美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品；1640培養(yǎng)基、新生牛血清、熒光染料calcein-AM為美國(guó)Gibco公司產(chǎn)品；ECL發(fā)光試劑盒購(gòu)于Invitrogen公司。Cx43單克隆抗體和PKC單克隆抗體均為Sigma公司產(chǎn)品，羊抗鼠β-actin單克隆抗體、山羊抗小鼠IgG抗體、山羊抗兔IgG抗體均購(gòu)自Proteintech公司。其他常用試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純級(jí)。

1.2 方法 肺癌細(xì)胞A549采用1640培養(yǎng)基，含有10%（V/V）新生牛血清、100 U/mL青霉素和100 mg·L-1鏈霉素，置于37oC、含體積分?jǐn)?shù)5% CO2以及飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)于培養(yǎng)瓶中，0.25%胰蛋白酶溶液消化傳代，一周傳代2次-3次，傳代比例約為1:3。細(xì)胞接種熒光示蹤法[6]測(cè)定A549細(xì)胞間GJ功能。本實(shí)驗(yàn)將A549細(xì)胞與熒光指示劑calcine-AM共同孵育，使calcine-AM進(jìn)入細(xì)胞。該細(xì)胞稱(chēng)為“供體細(xì)胞”（donor cell）。將“供體細(xì)胞”接種到表達(dá)有相同Cx，已生長(zhǎng)融合的A549細(xì)胞（“接受細(xì)胞”，receiver cells）上，培養(yǎng)4 h。待形成穩(wěn)定的GJ后，小分子的calcine（發(fā)綠色熒光）可以通過(guò)GJ進(jìn)入相鄰的“接受細(xì)胞”，用熒光顯微鏡觀(guān)察，記錄GJ熒光傳遞功能。一個(gè)“供體細(xì)胞”周?chē)衏alcine的“接受細(xì)胞”數(shù)目多少作為GJ功能指標(biāo)。采用0.1 μM、1 μM、10 μM的黃連素分別預(yù)處理細(xì)胞24 h后，棄原培養(yǎng)基，1×PBS洗1次，加入“供體細(xì)胞”后孵育4 h后進(jìn)行拍照統(tǒng)計(jì)。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞集落克隆實(shí)驗(yàn) 本研究采用Glazer報(bào)道的“標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞集落形成分析法”[7]，測(cè)定順鉑對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞的細(xì)胞集落（克?。┬纬傻挠绊憽１緦?shí)驗(yàn)獲得生長(zhǎng)融合的細(xì)胞（以6×105cells/mL接種，細(xì)胞之間緊密接觸，有條件形成GJ）及生長(zhǎng)未融合細(xì)胞（以1,000 cells/mL接種，細(xì)胞之間無(wú)條件形成GJ），首先采用10 μM黃連素預(yù)處理A549細(xì)胞24 h后，棄原培養(yǎng)基，再加入5 μM順鉑處理細(xì)胞1 h，測(cè)定細(xì)胞7天的集落形成率；比較生長(zhǎng)融合細(xì)胞與生長(zhǎng)未融合細(xì)胞的順鉑毒性大小，為了避免不同生長(zhǎng)期的細(xì)胞對(duì)順鉑敏感性的差異對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，細(xì)胞在加入藥物前24 h用無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)，使所有細(xì)胞均同步在G1期。

1.4 Western blot檢測(cè)A549細(xì)胞內(nèi)Cx43及PKC蛋白表達(dá) 黃連素（0.1 μM、1 μM、10 μM）分別作用于細(xì)胞24 h后，冰上收集細(xì)胞，裂解30 min，提取細(xì)胞總蛋白，BCA蛋白定量法（參照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作）測(cè)各組蛋白濃度，用細(xì)胞裂解液將各組蛋白稀釋至相同濃度，與2×上樣緩沖液1:1混合，100oC煮沸5 min使蛋白變性。經(jīng)SDS-PAGE電泳（10%分離膠）分離后電轉(zhuǎn)印至PVDF膜上。脫脂牛奶室溫封閉；Cx43一抗：1:4,000稀釋?zhuān)琍KC一抗：1:1,000稀釋?zhuān)?oC孵育過(guò)夜；TPBS洗滌3次×15 min；山羊抗小鼠IgG抗體1:4,000稀釋?zhuān)窖蚩雇肐gG二抗1:5,000稀釋室溫孵育2 h；TPBS洗滌3次×15 min，0.01 M PBS洗滌1次×15 min；ECL發(fā)光試劑盒顯影曝光。Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)采集圖像，Bio Imaging System（Gene Genius）對(duì)膠片進(jìn)行灰度值掃描分析。以β-actin為內(nèi)參對(duì)照，蛋白表達(dá)強(qiáng)度以Cx43蛋白表達(dá)灰度值與β-actin灰度值的比值表示[8,9]。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 實(shí)驗(yàn)結(jié)果使用SPSS 13.0軟件進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)資料以Mean±SD表示，整體比較采用ANOVA，組間采用q檢驗(yàn)，組間比較P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。統(tǒng)計(jì)圖表采用Sigma Plot 12.0繪制。

2 結(jié)果

2.1 黃連素對(duì)A549細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用 本實(shí)驗(yàn)采用不同濃度的黃連素（2.5 μM、5.0 μM、10.0 μM、20.0 μM、40.0 μM、80.0 μM）預(yù)處理A549細(xì)胞24 h，觀(guān)察藥物對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，黃連素在0 μM-10 μM的濃度范圍對(duì)A549細(xì)胞無(wú)毒性，10 μM的黃連素刺激細(xì)胞24 h后，細(xì)胞存活率為（95.24±4.19）%，仍高于95%。而在黃連素濃度高于10 μM時(shí)，隨著藥物濃度的增加，黃連素對(duì)A549細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用明顯增加，且各藥物濃度組對(duì)A549細(xì)胞的存活率與空白對(duì)照組比較，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.049,9, P=0.010,9, P=0.000,5, P＜0.001,P＜0.001, P＜0.001）（圖1）。

2.2 黃連素對(duì)A549細(xì)胞縫隙連接功能的影響 本實(shí)驗(yàn)采用不同濃度黃連素（0 μM、0.1 μM、1 μM、10 μM）預(yù)處理A549細(xì)胞24 h，細(xì)胞接種熒光示蹤法實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：黃連素在0 μM-10 μM范圍內(nèi)可以增強(qiáng)細(xì)胞間的熒光傳遞，與空白對(duì)照組相比，黃連素預(yù)處理后的細(xì)胞間熒光傳遞功能分別增加了33.3% （P=0.002,3）、67.0%（P＜0.001）、160.0%（P＜0.001）（圖2）。

2.3 黃連素對(duì)順鉑細(xì)胞毒性的影響 本實(shí)驗(yàn)分別在有GJ形成的細(xì)胞（生長(zhǎng)融合）和無(wú)GJ形成的細(xì)胞（生長(zhǎng)未融合）的條件下，采用“標(biāo)準(zhǔn)集落形成法”觀(guān)察10 μM 黃連素（從圖1結(jié)果可知，在該濃度下，黃連素本身對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)無(wú)影響）對(duì)順鉑細(xì)胞毒性的影響。黃連素預(yù)處理A549細(xì)胞24 h后，再加入5 μM順鉑處理細(xì)胞1 h，觀(guān)察順鉑的細(xì)胞毒性變化。

圖1 黃連素對(duì)A549細(xì)胞存活率的影響（n=3）。A549細(xì)胞用2.5 μM-80 μM黃連素處理24 h. 與對(duì)照組相比：*P＜0.05，**P＜0.01。Fig 1 Cytotoxicity of berberine on A549 cells for 24 h (n=3).A549 cells were exposed to 2.5 μM-80 μM berberine for 24 h.*P＜0.05, **P＜0.01, vs control group.

圖2 黃連素對(duì)A549細(xì)胞GJ功能的影響（×400, n=3）A549細(xì)胞用0 μM-10 μM黃連素處理24 h，對(duì)照組為空白培養(yǎng)基。與對(duì)照組相比：*P＜0.05, **P＜0.01。Fig 2 Effects of berberine on dye spread in A549 cells (×400, n=3). A549 cells were exposed to 0 μM-10 μM berberine for 24 h.*P＜0.05, **P＜0.01, vs control group.

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在生長(zhǎng)融合的細(xì)胞中（有GJ形成），順鉑單用組的細(xì)胞集落形成率為（0.43±0.03）%，低于生長(zhǎng)未融合的細(xì)胞（無(wú)GJ形成）（0.53±0.05）%。在生長(zhǎng)融合的細(xì)胞中，用黃連素（10 μM）增強(qiáng)細(xì)胞GJ功能，細(xì)胞集落形成率為（0.27±0.04）%，與單用順鉑組相比降低（P=0.002,3）。而在生長(zhǎng)未融合的細(xì)胞中，無(wú)GJ形成，與順鉑組相比，用黃連素預(yù)處理細(xì)胞，不影響順鉑處理后的細(xì)胞集落形成 （P=0.067,2）。結(jié)果表明，在有GJ形成的細(xì)胞，黃連素能顯著增加順鉑的細(xì)胞毒性，而在無(wú)GJ形成的細(xì)胞，黃連素對(duì)順鉑的細(xì)胞毒性無(wú)顯著影響（圖3）。

圖3 黃連素對(duì)順鉑細(xì)胞毒性的影響（n=3）。在高低密度情況下，檢測(cè)10 μM黃連素預(yù)處理細(xì)胞24 h，再聯(lián)合使用5 μM順鉑后A549細(xì)胞存活率。與黃連素組相比：**P＜0.01，與順鉑組相比：##P＜0.01。Fig 3 Effects of berberine on the cytotoxicity of cisplatin in A549 cells (n=3). Surviving fraction of A549 cells by 5 μM cisplatin for 24 h at high and low cell density and pretreated with 10 μM berberine.**P＜0.01, vs berberine group; ##P＜0.01, vs cisplatin group.

2.4 黃連素對(duì)A549細(xì)胞Cx43蛋白表達(dá)的影響 本實(shí)驗(yàn)采用不同濃度黃連素（0 μM、0.1 μM、1 μM、10 μM）分別預(yù)處理A549細(xì)胞24 h，細(xì)胞中Cx43蛋白的表達(dá)水平增加。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，黃連素增強(qiáng)A549細(xì)胞GJ功能與增加了細(xì)胞內(nèi)Cx43蛋白表達(dá)有關(guān)（圖4）。

圖 4 黃連素對(duì)A549細(xì)胞中Cx43蛋白表達(dá)的影響（n=3）。A549細(xì)胞用0 μM-10 μM黃連素處理24 h，對(duì)照組為空白培養(yǎng)基。Fig 4 Effects of berberine on Cx43 expression in A549 cells determined by Western blot (n=3). A549 cells were exposed to 0 μM-10 μM berberine for 24 h

2.5 黃連素對(duì)A549細(xì)胞膜Cx43蛋白表達(dá)的影響 由于連接蛋白必須被轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞膜，與相鄰細(xì)胞形成GJ才能夠允許物質(zhì)進(jìn)行交換。因此本實(shí)驗(yàn)采用細(xì)胞免疫熒光法觀(guān)察了黃連素對(duì)A549細(xì)胞膜表面Cx43蛋白表達(dá)的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，0 μM-10 μM黃連素預(yù)處理A549細(xì)胞24 h，可以提高細(xì)胞膜Cx43蛋白表達(dá)水平，且隨著藥物濃度的增加，胞膜Cx43蛋白表達(dá)越多（圖5）。這提示，黃連素在0 μM-10 μM的濃度范圍內(nèi)是通過(guò)增加細(xì)胞膜Cx43蛋白的表達(dá)進(jìn)而增強(qiáng)了細(xì)胞的GJ功能。

2.6 黃連素對(duì)A549細(xì)胞中PKC蛋白表達(dá)的影響 采用不同濃度黃連素（0 μM、0.1 μM、1 μM、10 μM）預(yù)處理A549細(xì)胞24 h，細(xì)胞中PKC蛋白的表達(dá)水平降低。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示：黃連素增加Cx43蛋白表達(dá)可能與PKC的活性被抑制有關(guān)（圖6）。

圖 5 黃連素對(duì)A549細(xì)胞膜Cx43蛋白表達(dá)的影響（n=3）。A549細(xì)胞用0 μM-10 μM黃連素處理24 h，對(duì)照組為空白培養(yǎng)基。Fig 5 Effects of berberine on Cx43 expression on the surface of A549 cells (n=3).A549 cells were exposed to 0 μM-10 μM berberine for 24 h.

圖 6 黃連素對(duì)A549細(xì)胞中PKC蛋白表達(dá)的影響（n=3）。A549細(xì)胞用0 μM-10 μM黃連素處理24 h，對(duì)照組為空白培養(yǎng)基。Fig 6 Effects of berberine on PKC expression in A549 cells(n=3)(control: DMSO). A549 cells were exposed to 0 μM-10 μM berberine for 24 h.

2.7 PKC抑制劑對(duì)細(xì)胞Cx43蛋白表達(dá)的影響 為了進(jìn)一步證明PKC的活性可以直接影響到細(xì)胞Cx43蛋白的表達(dá)，本實(shí)驗(yàn)采用PKC特異性的抑制劑GF109203X 8 μM作用于A549細(xì)胞1 h，觀(guān)察對(duì)Cx43蛋白表達(dá)的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：GF109203X在抑制PKC活性的同時(shí)，可以顯著增加Cx43的表達(dá)（圖7）。這表明：PKC的活性可以調(diào)控細(xì)胞Cx43蛋白。本實(shí)驗(yàn)證明了黃連素就是通過(guò)抑制PKC的活性而增強(qiáng)了Cx43蛋白的表達(dá)和細(xì)胞GJ功能，進(jìn)而增加順鉑的抗腫瘤作用。

圖 7 GF109203X對(duì)A549細(xì)胞中Cx43蛋白表達(dá)的影響（n=3）。A549細(xì)胞用8 μM GF109203X處理24 h，對(duì)照組為空白培養(yǎng)基。Fig 7 Effects of GF109203X on Cx43 expression in A549 cells(n=3)(control: DMSO). A549 cells were exposed to 8 μM GF109203X for 24 h.

3 討論

GJ是細(xì)胞間進(jìn)行物質(zhì)交流的重要連接通道，由特殊的通道蛋白——Cx組成[10]。由GJ介導(dǎo)的細(xì)胞間信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)對(duì)于細(xì)胞正常生理功能及機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定至關(guān)重要。

本研究在肺癌細(xì)胞A549中研究了黃連素對(duì)順鉑細(xì)胞毒性的影響，并探討可能機(jī)制。本研究首先采用細(xì)胞接種熒光示蹤法觀(guān)察黃連素對(duì)A549細(xì)胞的GJ功能影響，結(jié)果顯示1 μM-10 μM黃連素 (不影響細(xì)胞生長(zhǎng))可以增強(qiáng)細(xì)胞的GJ功能；接著采用高低密度接種法接種細(xì)胞，在高密度接種細(xì)胞時(shí)（有條件形成GJ），黃連素可以明顯增強(qiáng)順鉑的細(xì)胞毒性，而在低密度接種細(xì)胞時(shí)（無(wú)條件形成GJ），黃連素不影響順鉑的細(xì)胞毒性。這表明，黃連素通過(guò)增強(qiáng)A549細(xì)胞GJ功能而增加順鉑的抗腫瘤作用。

藥物主要通過(guò)兩種方法影響細(xì)胞的GJ功能：直接改變縫隙連接通道的通透性[11]和調(diào)控細(xì)胞中Cx的表達(dá)及轉(zhuǎn)運(yùn)[12]。肺腺癌細(xì)胞A549中表達(dá)最多的連接蛋白為Cx43[13]，于是本實(shí)驗(yàn)觀(guān)察了黃連素對(duì)A549細(xì)胞內(nèi)Cx43總蛋白表達(dá)的影響，結(jié)果顯示在一定濃度范圍內(nèi)，黃連素可以增加細(xì)胞中Cx43蛋白的表達(dá)。這提示：黃連素就是通過(guò)增加細(xì)胞中Cx43蛋白的表達(dá)水平而增強(qiáng)細(xì)胞GJ功能。

Cx43從轉(zhuǎn)錄、翻譯到轉(zhuǎn)運(yùn)至胞膜的過(guò)程中受到各種因素的調(diào)控，翻譯后調(diào)控[14]中的蛋白磷酸化[15]已經(jīng)成為當(dāng)今研究熱點(diǎn)。Cx43蛋白磷酸化的狀態(tài)不同程度地影響了自身的合成及細(xì)胞的縫隙連接通訊，進(jìn)而影響機(jī)體生理或者病理過(guò)程。Cx43的磷酸化受到多種激酶途徑的調(diào)節(jié)，如Liao等[16]在新生大鼠的心肌細(xì)胞中觀(guān)察到PKC的活性被溶血磷脂膽堿誘導(dǎo)后可以引起Cx43的絲氨酸磷酸化。于是我們推測(cè)黃連素在A549細(xì)胞中可能是通過(guò)抑制PKC的活性而阻礙了Cx43的磷酸化。本研究結(jié)果也表明黃連素可以抑制A549細(xì)胞PKC蛋白的表達(dá)。為了證明在肺癌細(xì)胞A549中PKC的抑制可以增加Cx43總蛋白的表達(dá)，實(shí)驗(yàn)采用PKC抑制劑GF109203X預(yù)處理A549細(xì)胞，結(jié)果顯示GF109203X預(yù)處理的細(xì)胞Cx43表達(dá)增加。

PKC是一種由第二信使激活的磷脂依賴(lài)性蛋白激酶，它在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和腫瘤細(xì)胞增殖中起關(guān)鍵作用。有研究[17]表明，PKC介導(dǎo)的Cx43磷酸化可以減少GJ的裝配、下調(diào)GJIC，并且縮短Cx43的半衰期；也有研究[18]證明使用PKC抑制劑可以增加細(xì)胞GJ的電偶聯(lián)，而與細(xì)胞Cx43蛋白的分布及蛋白磷酸化的狀態(tài)無(wú)關(guān)。這表明，PKC影響細(xì)胞GJ功能是否與調(diào)控Cx43相關(guān)具有組織差異性。本研究證明了，在肺腺癌細(xì)胞A549中PKC對(duì)細(xì)胞GJ功能的調(diào)控是通過(guò)影響Cx43的表達(dá)而實(shí)現(xiàn)的。

本研究為臨床肺癌晚期治療用藥選擇提供了參考依據(jù)，為順鉑在臨床的擴(kuò)大應(yīng)用提供了新的方向，GJ的調(diào)控可能會(huì)成為未來(lái)肺癌治療的新靶點(diǎn)。