李靜 武新虎 王振 沈澤天 孫妮 朱錫旭

以吉非替尼為代表的表皮生長(zhǎng)因子受體酪氨酸激酶抑制劑（epidermal growth factor receptor-tyrosine kinase inhibitor, EGFR-TKI）是肺癌治療的有效方法，尤其對(duì)EGFR突變的、非吸煙、亞裔女性患者，其療效尤為顯著；遺憾的是隨著治療時(shí)間的推移，TKI的耐藥不可避免。研究[1-4]證實(shí)EGFR基因的二次突變（T790M）與至少50%的耐藥患者相關(guān)。目前，EGFR-TKI耐藥患者的后續(xù)治療成為亟待解決的重要問(wèn)題。放射治療是非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）治療的重要方法。理論上講，放射治療可以迅速消除局部病灶，能夠有效降低系統(tǒng)治療中存在的耐藥性；與此同時(shí)，越來(lái)越多的臨床回顧性分析結(jié)果[5-7]提示：TKI治療期間進(jìn)行局部治療可以降低患者的抗藥性，顯著延長(zhǎng)患者的無(wú)進(jìn)展生存期及總生存期，使患者獲益。本研究旨在探討電離輻射對(duì)NSCLC細(xì)胞株T790M突變所致耐藥的影響，為探索TKI耐藥NSCLC患者的治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株及主要試劑 人肺腺癌H1975、H3255細(xì)胞株均購(gòu)于北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院、EGFR基因突變檢測(cè)試劑盒購(gòu)于廈門(mén)艾德生物技術(shù)有限公司、吉非替尼（Gefitinib）粉劑購(gòu)于大連美侖生物技術(shù)有限公司、DMEM培養(yǎng)基為美國(guó)GIBCO公司產(chǎn)品、DNA提取試劑盒為美國(guó)Omega公司產(chǎn)品、MTT粉劑為美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品、直線(xiàn)加速器為瑞士醫(yī)科達(dá)公司產(chǎn)品、激光共聚焦顯微鏡為日本Olymupus公司產(chǎn)品、PCR擴(kuò)增儀ABI7900為美國(guó)ABI公司產(chǎn)品、酶標(biāo)儀Micoplate Reader 450為美國(guó)Bio-Rad公司產(chǎn)品。

1.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的H1975、H3255細(xì)胞按DNA提取試劑盒的操作步驟提取細(xì)胞DNA，測(cè)定其濃度；將提取的DNA用超純水稀釋至終濃度為2 ng/μL；按照EGFR基因突變檢測(cè)試劑盒的操作步驟，加樣，上機(jī)，PCR反應(yīng)條件為：第一階段：95oC 5 min 1個(gè)循環(huán)；第二階段：95oC 25 s、64oC 20 s、72oC 20 s，15個(gè)循環(huán)；第三階段：93oC 25 s、60oC 35 s、72oC 20 s、31個(gè)循環(huán)；信號(hào)收集：第三階段60oC時(shí)收集FAM和HEX（或VIC）信號(hào)，執(zhí)行實(shí)時(shí)PCR，保存文件；實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次[8]。

1.3 克隆形成實(shí)驗(yàn) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，按照X線(xiàn)輻射劑量將不同數(shù)目的細(xì)胞分別接種于60 mm細(xì)胞培養(yǎng)皿中（0 Gy、2 Gy、4 Gy、6 Gy、8 Gy每皿接種細(xì)胞數(shù)分別為300個(gè)、600個(gè)、2×103個(gè)、5×103個(gè)、1×104個(gè)，每個(gè)劑量組設(shè)3個(gè)平行孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次）；細(xì)胞貼壁后用6 MV-X線(xiàn)進(jìn)行照射，置于37oC、5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)10 d-14 d，定期換液；當(dāng)肉眼可見(jiàn)細(xì)胞克隆時(shí)，棄去培養(yǎng)基，PBS沖洗3遍，4%多聚甲醛固定15 min；加入適量的結(jié)晶紫染液染色20 min左右，流水沖洗去除染液，室溫放置進(jìn)行干燥；倒置顯微鏡下計(jì)數(shù)每皿細(xì)胞克隆數(shù)（計(jì)數(shù)≥50個(gè)細(xì)胞的單克?。河?jì)算未照射組克隆形成率（plating efficicy, PE）和各個(gè)劑量下的細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)（survival fraction, SF），PE=（0 Gy劑量下形成的克隆數(shù)/細(xì)胞接種數(shù)）×100%，SF=某一劑量照射下細(xì)胞形成的克隆數(shù)/（該組細(xì)胞種植數(shù)×PE）。

1.4 MTT實(shí)驗(yàn) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度，按照5,000個(gè)每孔的密度接種于96孔板中，置于37oC、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h；細(xì)胞貼壁后用6 MV-X線(xiàn)分別按照0 Gy、1 Gy、1.5 Gy、2 Gy、2.5 Gy進(jìn)行照射；將Gefitinib用二甲基亞砜（DMSO）溶解，進(jìn)行倍比稀釋后每孔中加入設(shè)定濃度Gefitinib，稀釋至所需要的工作濃度。一般設(shè)5個(gè)-7個(gè)濃度梯度（實(shí)驗(yàn)中的濃度分別為：100 μmol/L、10 μmol/L、1 μmol/L、1×10-1μmol/L、1×10-2μmol/L、1×10-3μmol/L、1×10-4μmol/L、1×10-5μmol/L），每孔100 μL，設(shè)5個(gè)復(fù)孔；培養(yǎng)48 h后每孔中加入5 mg/mL的MTT溶液20 μL繼續(xù)孵育4 h；終止培養(yǎng)，吸去孔內(nèi)培養(yǎng)基，每孔加150 μL的DMSO置搖床上低速振蕩10 min，結(jié)晶物充分溶解后，酶標(biāo)儀（570 nm）測(cè)定各孔的吸光度值（A值）；設(shè)定調(diào)零孔、對(duì)照孔；按以下公式計(jì)算藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制率：

腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率=（1-實(shí)驗(yàn)組A值/對(duì)照組A值）×100%；將數(shù)據(jù)處理后，利用Graph Pad Prism 5軟件計(jì)算IC50（半數(shù)抑制濃度）[9]。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用Graph Pad Prism 5軟件和SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)分析軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，各組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，數(shù)據(jù)取均數(shù)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 H1975、H3255的EGFR基因突變狀態(tài) 采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法，對(duì)實(shí)驗(yàn)所用的H3255、H1975細(xì)胞株進(jìn)行EGFR基因檢測(cè)；結(jié)果驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)選擇的H1975細(xì)胞為L(zhǎng)858R+T790M雙突變株、H3255細(xì)胞為L(zhǎng)858R單突變株（圖1）。

2.2 T790M突變對(duì)放射敏感性的影響 克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示H1975與H3255細(xì)胞的SF2值分別為0.62和0.64。在相同條件處理下，兩株細(xì)胞生存分?jǐn)?shù)無(wú)明顯差異（P=0.952，圖2，圖3）。結(jié)果提示T790M突變對(duì)NSCLC細(xì)胞株的放射敏性無(wú)影響。

2.3 電離輻射對(duì)T790M突變所致吉非替尼耐藥的影響MTT法檢測(cè)不同劑量X線(xiàn)照射后吉非替尼對(duì)H1975、H3255細(xì)胞株增殖活性的影響，計(jì)算其半數(shù)抑制濃度IC50。未經(jīng)X線(xiàn)輻射組H1975的IC50為（3.520±0.821）μmol/L，經(jīng)2.5 Gy X線(xiàn)輻射后降低為（0.678±0.373）μmol/L，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.008）；未經(jīng)X線(xiàn)輻射組H3255的IC50為（0.041±0.020）μmol/L，經(jīng)2.5 Gy X線(xiàn)輻射后降低為（0.017±0.009）μmol/L（P=0.224）；未進(jìn)行電離輻射時(shí)，H1975的IC50是H3255的85.9倍，經(jīng)2.5Gy X線(xiàn)輻射后降為39.2倍（表1）。以上結(jié)果說(shuō)明T790M突變是NSCLC細(xì)胞耐藥的重要因素；電離輻射可降低NSCLC細(xì)胞株T790M突變所致的EGFR-TKI耐藥性。

表1 H1975、H3255細(xì)胞株不同處理組的IC50Tab 1 The IC50 of H1975 and H3255 in different treatment groups

3 討論

近年來(lái)，對(duì)于NSCLC的治療，化療的地位雖然未發(fā)生根本動(dòng)搖，但其療效已趨于平臺(tái)，較嚴(yán)重的毒副反應(yīng)也限制了臨床應(yīng)用。靶向治療因其可靠的療效且毒性和不良反應(yīng)輕，已成為最受關(guān)注和最有前途的治療方法之一[10,11]。40%-80%的NSCLC過(guò)度表達(dá)EGFR基因，是腫瘤發(fā)生、發(fā)展的關(guān)鍵因素，已成為肺癌治療的關(guān)鍵靶點(diǎn)。接受EGFR-TKI治療的EGFR基因敏感突變的NSCLC患者，通常在9個(gè)月-10個(gè)月后出現(xiàn)疾病進(jìn)展，提示出現(xiàn)繼發(fā)性耐藥[12-16]。

圖1 H1975、H3255細(xì)胞株的EGFR突變檢測(cè)圖（A、E：L858R突變陽(yáng)性質(zhì)控曲線(xiàn)；B、D：H1975細(xì)胞曲線(xiàn)；C：T790M突變陽(yáng)性質(zhì)控曲線(xiàn)；F：H3255細(xì)胞曲線(xiàn)）。Fig 1 The EGFR mutation curves of H1975 and H3255 (A, E: positive quality control curves of L858R mutation; B, D: curve of H1975 cell lines; C:positive quality control curves of T790M mutation; F: curve of H3255 cell lines). EGFR: epidermal growth factor receptor.

圖2 H3255、H1975細(xì)胞株的克隆形成情況。A: H3255細(xì)胞株；B:H1975細(xì)胞株。Fig 2 The cell clone situation of H3255 and H1975. A: H3255 cell lines; B: H1975 cell lines.

圖3 H3255和H1975細(xì)胞的劑量-生存曲線(xiàn)圖Fig3 The dose-survival curve of H3255 and H1975

對(duì)于EGFR-TKI耐藥后治療的高級(jí)別循證醫(yī)學(xué)證據(jù)較少，一系列的相關(guān)研究正在進(jìn)行中。一項(xiàng)回顧性研究探討了EGFR-TKI治療出現(xiàn)疾病進(jìn)展后的治療模式。根據(jù)患者的疾病控制時(shí)間、腫瘤負(fù)荷演變和臨床癥狀6項(xiàng)將患者分為快速進(jìn)展（疾病控制≥3個(gè)月，與以往評(píng)估相比，腫瘤負(fù)荷快速增加，增殖評(píng)分達(dá)到2分）、緩慢進(jìn)展（疾病控制≥6個(gè)月，與以往評(píng)估相比，腫瘤負(fù)荷輕微增加，癥狀評(píng)分≤1分）和局部進(jìn)展（疾病控制≥3個(gè)月，孤立性顱外進(jìn)展或顱內(nèi)進(jìn)展，癥狀評(píng)分≤1分）三種臨床失敗模式。結(jié)果提示緩慢或局部進(jìn)展的患者建議繼續(xù)TKI聯(lián)合局部治療[17]。放射治療，不管是單獨(dú)應(yīng)用或聯(lián)合化療，都在肺癌的治療中起到不可或缺的作用：早期的病灶中它是一種根治性的治療方法，而在轉(zhuǎn)移性病灶中它起到姑息性的治療作用[18]。越來(lái)越多的臨床回顧性分析結(jié)果提示，NSCLC患者EGRF-TKI治療期間對(duì)局部病灶或復(fù)發(fā)病灶進(jìn)行局部治療是一種有前景的治療方式，能夠提高TKI的療效。然而，有關(guān)放療對(duì)EGFR-TKI耐藥影響的基礎(chǔ)研究甚少。

本研究選擇NSCLC細(xì)胞株H3255、H1975為研究對(duì)象，兩株細(xì)胞均為EGFR基因突變株。其中，H1975為L(zhǎng)858R+T790M雙突變株，H3255為L(zhǎng)858R單突變株，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR再次驗(yàn)證兩株細(xì)胞的EGFR基因突變狀態(tài)，為下一步的研究奠定基礎(chǔ)。

本研究克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示相同劑量輻射條件下，兩株細(xì)胞的生存分?jǐn)?shù)未見(jiàn)明顯差異，這說(shuō)明兩株細(xì)胞的放射敏感性相同，T790M突變的存在對(duì)NSCLC細(xì)胞的放射敏感性無(wú)影響，這與既往的研究[19]結(jié)論相同。

利用MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)兩株細(xì)胞對(duì)吉非替尼的敏感性，結(jié)果提示未經(jīng)X線(xiàn)處理組H1975細(xì)胞株的IC50是H3255的85.9倍。既往Pao等[20]研究結(jié)果顯示，H1975細(xì)胞株對(duì)吉非替尼的敏感性比H3255小100倍，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與Pao等[20]研究結(jié)果相似，進(jìn)一步驗(yàn)證了T790M突變是NSCLC患者EGFR-TKI耐藥的重要原因。利用6 MV-X線(xiàn)對(duì)兩株細(xì)胞進(jìn)行不同劑量輻射，觀(guān)察兩株細(xì)胞對(duì)吉非替尼敏感性的變化，結(jié)果顯示H1975與H3255的IC50隨輻射劑量的增大逐漸降低；當(dāng)輻射劑量為2.5 Gy時(shí)，H3255與H1975細(xì)胞株的IC50之比，由85.9倍降低為39.2倍；說(shuō)明電離輻射可以降低NSCLC細(xì)胞株T790M突變所致TKI的抗藥性。電離輻射可使T790M突變所致吉非替尼耐藥發(fā)生逆轉(zhuǎn)，其機(jī)理尚不明確，需要更多更深入的研究，有研究認(rèn)為，其中一種可能是電離輻射使EGFR發(fā)生了第三次突變[21]；而Gerlinger等[22]的觀(guān)點(diǎn)則認(rèn)為由于腫瘤細(xì)胞存在遺傳克隆異質(zhì)性，電離輻射可使H1975的T790M突變量相對(duì)降低。

綜上所述，腫瘤的發(fā)生發(fā)展是多基因、多階段、多因素的過(guò)程，受腫瘤體積、藥物滲透性等因素的影響，單純靶向治療不能實(shí)現(xiàn)腫瘤根治性治療的目的。靶向治療和放療等治療方法結(jié)合是靶向治療發(fā)展的必由之路。本研究結(jié)果促使我們進(jìn)一步研究電離輻射降低TKI耐藥的可能機(jī)制，為EGFR-TKI耐藥患者的治療提出一種有希望的治療策略，為以后的綜合治療模式和臨床研究提供理論基礎(chǔ)。