湯軼波，袁偉暢，朱春燕，張　賽，張　瑋，張林朋，南一楠，牟天龍，王　旭，楊曉敏，何雪飛，潘彥舒

(北京中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)系，北京100029)

復(fù)方當(dāng)歸注射液對缺血性腦損傷大鼠BDNF表達(dá)的影響

湯軼波，袁偉暢，朱春燕，張賽，張瑋，張林朋，南一楠，牟天龍，王旭，楊曉敏，何雪飛，潘彥舒

(北京中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)系，北京100029)

目的：觀察復(fù)方當(dāng)歸注射液(CAI)對局灶性腦缺血損傷模型大鼠患側(cè)腦組織及血清中腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)表達(dá)水平的影響，探討CAI對腦缺血損傷的作用機制。方法：50只SD大鼠隨機分為假手術(shù)組(10只)和局灶性腦缺血損傷組(40只)。局灶性腦缺血損傷組采用線栓法復(fù)制大鼠局灶性腦缺血損傷模型，將造模成功的30只大鼠隨機分為模型組、CAI組和陽性對照依達(dá)拉奉組，每組10只。造模大鼠蘇醒后進(jìn)行神經(jīng)功能評分，7 d后取材，HE染色檢測大鼠腦組織的病理學(xué)改變，測定大鼠血清及缺血側(cè)腦組織中BDNF的表達(dá)水平。結(jié)果：與假手術(shù)組比較，模型組大鼠神經(jīng)功能評分增加(P<0.05)，大鼠神經(jīng)細(xì)胞出現(xiàn)腫脹、壞死和細(xì)胞間質(zhì)水腫等改變，缺血側(cè)腦組織及血清中BDNF表達(dá)水平有一定的上升趨勢；CAI組大鼠缺血側(cè)腦組織BDNF表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)，血清BDNF表達(dá)水平有所升高。與模型組比較，CAI組大鼠神經(jīng)功能評分降低，大鼠神經(jīng)細(xì)胞輕微水腫，缺血側(cè)腦組織及血清BDNF表達(dá)水平有所升高。結(jié)論：CAI可能具有提高腦內(nèi)BDNF表達(dá)的作用，其作用機制可能與機體在缺血損傷情況下腦內(nèi)相應(yīng)的神經(jīng)因子做出應(yīng)激反應(yīng)有關(guān)。

復(fù)方當(dāng)歸注射液；局灶性腦缺血；腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子；疾病模型，動物

復(fù)方當(dāng)歸注射液(Compound Angelica Injection,CAI)是一種中藥方劑，主要由當(dāng)歸、川穹和紅花等中藥精制而成[1]。具有活血通經(jīng)和祛瘀止痛的功效。近年來，該藥劑被廣泛應(yīng)用于哮喘、疼痛、高脂血癥以及部分婦科疾病等的臨床治療，收效顯著[2-4]。已有研究[5]證實：復(fù)方當(dāng)歸注射液改善缺血缺氧性損傷具有顯著作用，但有關(guān)其在缺血性腦損傷中作用的研究尚少。本課題組前期研究[6]發(fā)現(xiàn)：CAI能顯著改善缺血性腦損傷大鼠的神經(jīng)行為學(xué)功能，并減小大鼠的腦梗死體積。本研究探討復(fù)方當(dāng)歸注射液對大鼠局灶性腦缺血損傷后患側(cè)腦組織勻漿及血清腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain dervied neurotrophic factor,BDNF)表達(dá)的影響，闡明CAI發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用的可能機制。

1　材料與方法

1.1實驗動物、藥物、主要試劑和儀器健康清潔級雄性SD大鼠50只，體質(zhì)量250～270 g，購于北京維通利華實驗動物公司，動物許可證編號：SCXK(京)2012-0001。CAI購自福建古田藥業(yè)有限公司，批號1304062；依達(dá)拉奉注射液購自南京先聲東元制藥有限公司，批號80-130404；水合氯醛購自美國Sigma公司；BCA檢測試劑購自碧云天生物技術(shù)有限公司；BDNF ELISA KIT(CYT306)購自美國Millipore公司。SXP-1B型手術(shù)顯微鏡(上海醫(yī)用光學(xué)儀器廠)，1411型高頻小電刀(上海醫(yī)療器械技術(shù)公司)。

1.2動物分組和給藥50只SD大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d，室溫22～25℃， 濕度40%～60%。將大鼠隨機分為假手術(shù)組(10只)和局灶性腦缺血損傷組(40只)。局灶性腦缺血損傷組大鼠采用線栓法復(fù)制大鼠局灶性大腦中動脈缺血(MCAO)模型，將模型復(fù)制成功的30只大鼠隨機分為模型組、CAI組和陽性對照依達(dá)拉奉組，每組10只。造模1 h后，CAI組給予1 mL·100 g-1CAI腹腔注射，每日2次(合生藥0.2 g·100 g-1·d-1)，給藥劑量參考文獻(xiàn)[7]；陽性藥物組給予0.3 mL·100 g-1依達(dá)拉奉注射液腹腔注射，假手術(shù)組和模型組給予注射用生理鹽水0.3 mL·100 g-1腹腔注射，均每天給藥1次。

1.3大鼠局灶性腦缺血損傷動物模型的建立根據(jù)Longa等[8]報道的線栓法建立大鼠局灶性腦缺血模型：以10%水合氯醛溶液(0.4 mg·kg-1)腹腔注射麻醉。麻醉后將大鼠仰位固定，頸部正中切口，暴露左側(cè)頸動脈三角，逐層分離組織，依次分離左側(cè)頸總動脈(CCA)、頸外動脈(ECA)和頸內(nèi)動脈(ICA)。分離ECA的分支甲狀腺動脈，并電刀凝閉；分離頸外與頸內(nèi)動脈之間的枕動脈，電刀凝閉。結(jié)扎游離ECA主干，分離ICA主干至翼腭動脈(PPA)，用無損動脈夾分別夾閉CCA、ICA和PPA，用虹膜剪在ECA殘端剪一楔形小口，由此插入釣魚線(直徑約0.25 mm，頭端加熱呈直徑約0.3 mm的圓球形)，輕推釣魚線使之由頸外動脈通過分叉部進(jìn)入頸內(nèi)動脈，至大腦中動脈的起點，阻斷大腦中動脈的血液供應(yīng)，縫合頸部切口。假手術(shù)組手術(shù)過程與模型組相同，分離出左側(cè)頸總動脈、頸外動脈和頸內(nèi)動脈，但僅結(jié)扎頸外動脈。

1.4大鼠神經(jīng)功能評分造模大鼠蘇醒后進(jìn)行神經(jīng)功能評分。評分標(biāo)準(zhǔn)參照Longa的5級評分方法評定動物的神經(jīng)系統(tǒng)功能[8]。無神經(jīng)功能障礙記為0分，輕度神經(jīng)功能缺陷(左前肢伸展運動障礙等)記為1分，中度神經(jīng)功能缺陷(向左側(cè)轉(zhuǎn)圈)記為2分，嚴(yán)重神經(jīng)功能缺陷(向左側(cè)傾倒)記為3分，不能行走及意識水平降低記為4分。評分為1～3分者視為造模成功，納入實驗。造模7 d后再次對各組大鼠進(jìn)行神經(jīng)功能評分。

1.5大鼠血清和缺血側(cè)腦組織勻漿中BDNF表達(dá)水平檢測實驗結(jié)束后，每組動物麻醉、腹主動脈取血后斷頭處死，迅速取出全腦，分離出左側(cè)(患側(cè))半球，制成10% 腦組織勻漿，以BCA法測定各蛋白樣本濃度后待測。全血靜置離心、分離血清后待測。用ELISA試劑盒測定血清及腦組織勻漿中BDNF表達(dá)水平。

1.6大鼠腦組織病理學(xué)檢查實驗結(jié)束后，每組動物麻醉，以肝素經(jīng)主動脈弓灌注沖洗，滴注含10%甲醛的磷酸緩沖液灌注固定。取大鼠患者腦組織，用10%甲醛固定，梯度乙醇脫水處理，二甲苯透明，石蠟包埋，切片，而后使用二甲苯脫蠟，梯度乙醇復(fù)水，HE染色，顯微鏡下觀察腦組織的病理學(xué)變化。

2　結(jié)　果

2.1大鼠神經(jīng)功能評分假手術(shù)組大鼠神經(jīng)功能未見異常(0分)。與假手術(shù)組比較，模型組大鼠神經(jīng)功能評分顯著升高(P<0.05)，大鼠出現(xiàn)神經(jīng)功能障礙；與模型組比較，CAI和陽性對照組大鼠神經(jīng)功能評分均出現(xiàn)不同程度的下降(P<0.05)。見表1。

2.2各組大鼠血清中BDNF表達(dá)水平與假手術(shù)組比較，CAI 組和陽性對照組大鼠血清 BDNF表達(dá)水平升高，但差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。與模型組比較，CAI 組血清 BDNF表達(dá)水平升高，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

2.3各組大鼠患側(cè)腦組織勻漿中BDNF表達(dá)水平與假手術(shù)組比較，模型組大鼠腦組織 BDNF表達(dá)水平升高，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；CAI組腦組織勻漿中BDNF表達(dá)水平顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；陽性對照組腦組織勻漿中BDNF 表達(dá)水平也有不同程度的升高(P>0.05)。與模型組比較，CAI 組腦組織 BDNF表達(dá)水平升高，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1　各組大鼠神經(jīng)功能評分及血清和腦組織中BDNF水平

*P<0.05 compared with sham operation group;△P<0.05 compared with model group.

2.4大鼠腦組織病理學(xué)改變假手術(shù)組大鼠腦組織神經(jīng)細(xì)胞排列有序，形態(tài)正常，組織結(jié)構(gòu)清晰完整，細(xì)胞膜清晰完整，核仁清晰可見，無水腫及炎性細(xì)胞浸潤。模型組大鼠腦組織細(xì)胞排列紊亂，可見大量細(xì)胞變性、壞死，胞漿空化，核仁消失，細(xì)胞水腫。CAI及陽性對照組大鼠腦組織病理改變減輕，細(xì)胞排列較紊亂，胞核模糊或不可見，可見細(xì)胞變性、壞死，細(xì)胞水腫情況有所減輕。見圖1(插頁一)。

3　討　論

在缺血缺氧誘導(dǎo)的腦損傷中，神經(jīng)營養(yǎng)因子能發(fā)揮明確的神經(jīng)保護(hù)作用，如BDNF和胰島素樣生長因子1(insuline like growth factor-1, IGF-1)等在腦內(nèi)廣泛存在的因子，對各種原因造成的腦損傷均有積極的神經(jīng)保護(hù)作用[9-12]。

隨著人們對中醫(yī)藥研究的逐步深入，中醫(yī)藥在治療缺血性腦損傷方面的研究取得了巨大的進(jìn)展，如黃芪總苷(AST)和葛根素等在內(nèi)的中藥成分，在缺血性腦損傷中能發(fā)揮顯著的保護(hù)作用，并且這種保護(hù)作用與其提高腦內(nèi)的神經(jīng)營養(yǎng)因子，特別是BDNF的表達(dá)存在相關(guān)性[13-17]。本課題組前期研究[6]發(fā)現(xiàn)：CAI能顯著改善缺血性腦損傷大鼠的神經(jīng)行為學(xué)功能，減小大鼠的腦梗死體積。本實驗作為前期研究工作的深入，進(jìn)一步探討復(fù)方當(dāng)歸注射液對患側(cè)腦組織及血清中BDNF的表達(dá)是否有一定的干預(yù)作用。

本研究分析大鼠患側(cè)腦組織勻漿中BDNF表達(dá)水平發(fā)現(xiàn)：相對于假手術(shù)組，模型組、CAI組和陽性對照組的BDNF表達(dá)水平均有升高的趨勢，而CAI組BDNF表達(dá)水平升高有統(tǒng)計學(xué)意義。這個結(jié)果提示在缺血損傷發(fā)生后，機體可能會做出應(yīng)激反應(yīng)，腦內(nèi)相應(yīng)的神經(jīng)因子的表達(dá)出現(xiàn)上調(diào)。大鼠血清中BDNF表達(dá)水平變化結(jié)果顯示：假手術(shù)組動物血清中BDNF水平最低，其他3組BDNF水平均有一定升高趨勢，而以CAI組的絕對值最高。

綜合血清和患側(cè)腦組織勻漿中BDNF的變化規(guī)律，本文作者發(fā)現(xiàn)：實現(xiàn)MCAO造模后的3個組別大鼠的BDNF水平均出現(xiàn)了升高趨勢，尤以CAI組的數(shù)據(jù)絕對值為最高，這個結(jié)果提示CAI可能具有增加BDNF表達(dá)的作用。但在進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析處理時，幾個組間多未出現(xiàn)統(tǒng)計學(xué)差異，僅假手術(shù)組和CAI組大鼠患側(cè)腦組織勻漿中的數(shù)據(jù)比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義。出現(xiàn)這種情況的原因可能是：①樣本量。本實驗中指標(biāo)檢測方法為ELISA，樣本量為每組6～9只實驗動物，樣本量相對偏小；檢測數(shù)據(jù)整體離散度大，數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)差大，對統(tǒng)計學(xué)分析有一定的影響。②BDNF在腦內(nèi)的表達(dá)部位。文獻(xiàn)[18-19]報道：BDNF的表達(dá)部位較集中在梗死區(qū)邊緣的皮質(zhì)區(qū)、海馬區(qū)及半暗帶表達(dá)較密集。如果以免疫組織化學(xué)的方法在陽性顆粒表達(dá)密集的部位進(jìn)行組間比較，更容易找出組間的差異性。但以ELISA法將整個患側(cè)半球進(jìn)行勻漿后檢測，這種差異性會被弱化，增大樣本量可以提高結(jié)果的科學(xué)性。③檢測時間點的選擇。腦缺血后BDNF表達(dá)水平有一定的時相性，本實驗選擇缺血7 d，時間點單一，如果增加檢測的時間點，得到缺血后BDNF表達(dá)變化的連續(xù)性的數(shù)據(jù)對闡明CAI的干預(yù)規(guī)律將更有意義。

綜上所述，CAI對缺血性腦損傷大鼠的BDNF表達(dá)水平可能具有一定的作用，這個結(jié)果需要更大樣本量的實驗來驗證。

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Effect of Compound Angelica Injection on expression of brain derived neurotrophic factor of rats with cerebral ischemia injury

TANG Yibo, YUAN Weichang, ZHU Chunyan, ZHANG Sai, ZHANG Wei, ZHANG Linpeng, NAN Yinan，MU Tianlong,WANG Xu，YANG Xiaomin,HE Xuefei, PAN Yanshu

(Department of Pathology, College of Basic Medical Science, Beijing University of Chinese Medicine,Beijing 100029, China)

ObjectiveTo investigate the effect of Compound Angelica Injection (CAI) on the expressions of brain derived neurotrophic factor (BDNF) in brain tissue and serum in the rats with cerebral ischemia injury, and to explore the related mechanism of effect of CAI on cerebral ischemia injury. Methods50 SD rats were randomly divided into sham operation group (n=10) and cerebral ischemia injury group (n=40), and the rats in cerebral ischemia injury group were reproduced by middle cerebral artery occlusion (MCAO). Thirty successfully modeling rats were randomly divided into model group, CAI group and edaravone group (n=10). The neurologic scores of the rats after waking up were measured. The pathomorphology of brain tissue of the rats was detected by HE staining 7 d later. The levels of BDNF in the brain tissue and serum of the rats were detected. Results Compared with sham operation group, the neurologic score of the rats in model group was increased (P<0.05); the neurocytes of rats were changed to swell, necrosis, and interstitial edema; the levels of BDNF in brain tissue and serum showed a tendency of increasing; the level of BDNF in brain tissue of the rats in CAI group was increased significantly (P<0.05), and the serum BDNF level was a little higher. Compared with model group, the neurologic score of the rats in CAI group was decreased (P<0.05); the neurocytes of rats were mild edema; the levels of BDNF in brain tissue and serum showed a tendency of increasing. Conclusion CAI may has a positive function in increasing BDNF expression,and the mechanism may be related to the stress reaction of corresponding neural factors in brain tissue under ischemia injury condition.

Compound Angelica Injection;focal cerebral ischemia; brain derived neurotrophic factor;disease models,animal

1671-587Ⅹ(2015)06-1103-04

10.13481/j.1671-587x.20150601

2015-08-21

國家自然科學(xué)基金資助課題(81271897)；國家重點基礎(chǔ)研究發(fā)展計劃(973計劃)資助課題(2012CB518602)；北京中醫(yī)藥大學(xué)自主項目資助課題(2013-JYBZZ-JS-120)

湯軼波(1980-)，女，江蘇省張家港市人，講師，醫(yī)學(xué)博士，主要從事中醫(yī)藥治療缺血性腦病方面的研究。

潘彥舒，教授，碩士研究生導(dǎo)師(Tel: 010-64286887，E-mail: panyanshu@263.net)

R285.5

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