宋　飛，高素君，張云蔚，杜雅哲，王　露，王瑞芳，蘇　龍

(吉林大學第一醫(yī)院腫瘤中心，吉林 長春 130021)

淫羊藿苷對NB4白血病細胞株增殖和凋亡的影響及其作用機制

宋飛，高素君，張云蔚，杜雅哲，王露，王瑞芳，蘇龍

(吉林大學第一醫(yī)院腫瘤中心，吉林 長春 130021)

目的：研究淫羊藿苷(ICA)對急性早幼粒細胞白血病NB4細胞株增殖和凋亡的影響，探討其作用機制。方法：選取處于對數(shù)生長期的 NB4細胞，隨機分為空白對照組和不同濃度(4、8、16、32和64 μmol·L-1)ICA組，采用MTT法檢測作用不同時間(24、48和72 h)后各組 NB4細胞增殖活性,流式細胞術(shù)檢測各組細胞24 h時細胞周期進程及48 h時凋亡情況，采用Western blotting法檢測各組NB4細胞48 h時凋亡相關(guān)蛋白的表達水平。結(jié)果：細胞培養(yǎng)不同時間(24、48和72 h)后，各ICA組細胞增殖抑制率高于空白對照組(P<0.05)，隨ICA濃度增加和作用時間延長，細胞增殖抑制率升高(P<0.05)。各濃度ICA(4、8、16、32和64 μmol·L-1)組NB4細胞48 h后細胞凋亡率分別為(6.52±4.12)%、(10.07±2.36)%、(15.41±3.64)%、(25.18±1.24)%和(29.41±1.43)%，與空白對照組[(2.39±1.87)%]比較差異均有統(tǒng)計學意義(P< 0.05)。各濃度ICA(8、16、32和64 μmol·L-1)組NB4細胞24 h后 S期NB4細胞百分率降低，G1期細胞百分率升高，與空白對照組比較差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。Western blotting 檢測，與空白對照組比較，各濃度ICA組NB4細胞Bcl-2蛋白表達水平明顯降低(P<0.05)，而Bax蛋白表達水平明顯升高(P<0.05)。結(jié)論：ICA通過抑制Bcl-2蛋白表達水平和上調(diào)Bax蛋白表達水平誘導急性早幼粒細胞白血病NB4細胞株凋亡。

淫羊藿苷；白血?。籒B4細胞；細胞凋亡

淫羊藿為中國傳統(tǒng)的補益中藥，其主要成分為黃酮類化合物，淫羊藿苷(Icariin,ICA)就是從淫羊藿中提取的黃酮類單體成分。國內(nèi)外研究表明：ICA對多種實體瘤細胞具有抑制增殖及誘導凋亡作用。在血液系統(tǒng)腫瘤方面，ICA可抑制急性髓系白血病細胞株HL-60細胞增殖，并誘導其凋亡及分化[1-2]，同時對慢性粒細胞白血病細胞株K562細胞也具有抑制增殖和誘導凋亡作用[3]。急性早幼粒細胞白血病(acute promyelocytic leukemia,APL)NB4細胞株具有t(15;17)(q22;q21)，且PML/RARα融合基因陽性，是體外研究APL的理想模型。有關(guān)ICA對APL作用的研究國內(nèi)外尚無相關(guān)報道。本研究探討ICA對典型APL NB4細胞株的增殖抑制和凋亡誘導作用及機制，旨在為ICA在APL治療中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1主要試劑和儀器ICA粉劑由南京澤朗科技公司提供，純度為98%，用二甲基亞砜(DMSO)配制成母液，-20℃保存，使用時用培養(yǎng)基稀釋(使DMSO濃度<0.1%)；溴化四甲基偶氮唑藍(MTT)(美國Sigma公司)，用10 mL PBS溶解50 mg MTT，使其濃度為5 g·L-1，4℃避光保存，2周內(nèi)使用；RPMI-1640培養(yǎng)基(美國Gibco公司)；Armexinv/PI凋亡檢測試劑盒(北京碧云天生物制品公司)；Bcl-2(兔抗人)和BAX(兔抗人)抗體(武漢博士德生物制品公司)；辣根過氧化物酶(HRP)標記的羊抗兔 IgG(美國Sigma公司)；ECL化學發(fā)光試劑盒(美國Piece Biotechnology公司)；Western blotting細胞裂解液和BCA蛋白濃度測定試劑盒(北京碧云天生物技術(shù)公司)。BB16UVCO2培養(yǎng)箱(德國Heraeus公司)，PCR擴增儀(美國Eppendorf公司)，水浴式電轉(zhuǎn)印槽DYY-Ⅲ40B型(北京六一儀器廠)，凝膠自動成像儀GDS 8000和電泳儀(美國Bio-Rad公司)，Sundrise自動酶標檢測儀(美國Tecan公司)，流式細胞儀(美國貝克曼庫爾特有限公司)。

1.2細胞培養(yǎng)NB4細胞為懸浮生長細胞株，由本實驗室保存，培養(yǎng)于含10%胎牛血清、100 U·mL-1青霉素和100 mg·L-1鏈霉素的RPML 1640培養(yǎng)基中，常規(guī)傳代培養(yǎng)，取對數(shù)生長期細胞，以每孔5×104個細胞接種于96孔板，加入等體積不同濃度ICA，使終濃度為4、8、16、32和64 μmol·L-1，空白對照組中加等體積培養(yǎng)液，進行下一步實驗。

1.3MTT法檢測細胞增殖抑制率取對數(shù)生長期NB4細胞，以每孔5×104個細胞接種于96孔板，加入等體積終濃度分別為4、8、16、32和64 μmol·L-1ICA，空白對照組中加等體積培養(yǎng)液，每組設(shè)3個平行孔，37℃、5% CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中孵育20、44和68 h后，加入20 μL/孔MTT(5 g·L-1)，同等條件下繼續(xù)培養(yǎng)4 h，終止培養(yǎng)，加入100 μL/孔新三聯(lián)溶液，繼續(xù)上述條件下培養(yǎng)12 ～ 16 h后，酶標儀570 nm處測各孔吸光度(A570)值，取3孔平均值計算細胞增殖抑制率，檢測對照組和各濃度ICA組細胞生長抑制率。細胞生長抑制率 = (1-實驗組A570值/對照組A570值) × 100%。

1.4流式細胞術(shù)檢測細胞周期進程以1×106個細胞接種，ICA組藥物濃度為8、16、32和64 μmol·L-1，空白對照組加等體積培養(yǎng)液，作用24 h后，收集細胞，PBS洗2次，75%冷乙醇固定12 h以上，上機前棄乙醇，PBS洗1次，加入Rnase 100 mg·L-1，加入5 g·L-1碘化丙啶(PI)染色劑，室溫下避光染色30 min，在流式細胞儀上檢測，利用CellQuest分析軟件分析各組G1和S期NB4細胞所占百分率。

1.5流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡率ICA組藥物終濃度分別為4、8、16、32和64 μmol·L-1，空白對照組加等體積的培養(yǎng)液，培養(yǎng)48 h，收集各組細胞1×106個，冷PBS洗滌2次后，用Annexin結(jié)合緩沖液50 μL懸浮細胞，加Annexin Ⅴ/FITC 5 μL，室溫下避光放置10 min，加PI 10 μL，混合后室溫避光放置5 min，冷PBS洗1次，再加300 μL Annexin結(jié)合緩沖液懸浮細胞，立即在流式細胞儀上檢測，結(jié)果以細胞凋亡率表示。細胞凋亡率=凋亡細胞數(shù)/(凋亡細胞數(shù)+正常細胞數(shù))×100%。

1.6Western blotting法檢測Bcl-2和Bax蛋白表達水平實驗組藥物終濃度分別為8、16、32和64 μmol·L-1，空白對照組加等體積培養(yǎng)液，培養(yǎng)48 h，按照蛋白抽提試劑盒說明書提取各組細胞總蛋白，BCA法測定蛋白濃度。取等量蛋白進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(PVDF)。用含脫脂奶粉的TBST室溫封閉2 h，加入一抗(Bcl-2 1∶800，Bax 1∶800)，室溫孵育60 min，4℃過夜，加入HRP偶聯(lián)的二抗(1∶1 000)，室溫孵育2 h，ECL試劑顯色。ZEISS全自動圖像分析儀分析，以Image J分析軟件測量條帶灰度值，以目的條帶與β-actin條帶灰度值比值作為該目的蛋白的相對表達量。

2　結(jié)　果

2.1MTT法檢測各組細胞增殖抑制率ICA呈濃度依賴性抑制NB4細胞增殖，隨著ICA濃度的增加，ICA各濃度組增殖抑制率逐漸升高，與空白對照組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。ICA作用NB4細胞后，其增殖抑制率也呈時間依賴性。見表1。

表1　各濃度ICA組作用24、48和72 h時NB4細胞增殖抑制率

*P<0.05 compared with blank control group.

2.2流式細胞術(shù)檢測各組細胞的細胞周期與空白對照組比較，各濃度ICA組S期NB4細胞百分率降低(P<0.05)，隨著藥物濃度的增加，G1期細胞百分率升高(P<0.05)，且呈濃度效應(yīng)關(guān)系。見表2。

2.3流式細胞術(shù)檢測各組細胞凋亡率各濃度ICA(4、8、16、32和64 μmol·L-1)組NB4細胞48 h時細胞凋亡率分別為(6.52±4.12)%、(10.07±2.36)%、(15.41±3.64)%、(25.18±1.24)%和(29.41±1.43)%，與空白對照組(2.39±1.87)%比較差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

2.4各組細胞凋亡相關(guān)蛋白表達水平各濃度ICA( 8、16、32和64 μmol·L-1)組NB4細胞48 h時Bcl-2蛋白表達水平較空白對照組明顯降低(P<0.05)，而Bax蛋白表達水平高于空白對照組(P<0.05)。見圖1和表3。

表2各組NB4細胞各周期細胞百分率

*P<0.05 compared with blank control group.

Lane 1: Blank control group；Lane 2-5:8,16,32,64 μmol·L-1ICA groups.

圖1Western blotting 法檢測各組NB4細胞凋亡相關(guān)蛋白表達電泳圖

Fig.1Electrophoregram of expressions of apoptosis-associated proteins in NB4 cells detected by Western blotting method in various groups after treated for 48 h

表3各組NB4細胞凋亡相關(guān)蛋白表達水平

Tab.3Expression levels of apoptosis-associated proteins in NB4 cells in various groups

GroupBcl-2/β-actinBax/β-actinBlankcontrol1.203±0.0250.235±0.075ICA(μmol·L-1) 80.064±0.011*0.312±0.056* 160.053±0.005*0.421±0.008* 320.041±0.023*0.503±0.075* 640.029±0.007*0.624±0.126*

*P<0.05 compared with blank control group.

3　討　論

APL是一類預后良好的白血病，骨髓中以異常的早幼粒細胞增多為主，90%以上伴有特征性染色體改變：t(15;17)(q22；q21)，形成PML/RARα融合基因，臨床上以出血為主要表現(xiàn)，長期生存率達80%以上。

早期研究[1-3]顯示：ICA可抑制急性髓系白血病細胞HL-60及慢性粒細胞白血病K562細胞增殖，并誘導其分化和凋亡，但對APL細胞株國內(nèi)外尚無相關(guān)報道。本研究選用典型APL細胞NB4細胞株，ICA對其增殖影響的結(jié)果表明：ICA顯著抑制NB4細胞增殖，且呈時間-劑量依賴性。許多中藥的有效成分能夠作用于腫瘤細胞周期某一環(huán)節(jié)，從而使細胞增殖受阻、誘導凋亡。研究[4-6]發(fā)現(xiàn)：ICA可使胃癌細胞、膀胱癌細胞和前列腺癌細胞周期阻滯于G1期，從而抑制腫瘤增殖，還可逆轉(zhuǎn)人甲狀腺癌SW579細胞系的惡性表型，通過下調(diào)Id-1 mRNA水平來激活p21基因表達[7]，從而使SW579細胞從S期向G1/G0期逆轉(zhuǎn)，完成誘導分化。上述實驗結(jié)果表明：ICA對腫瘤細胞增殖抑制的機制為影響細胞周期，對不同的腫瘤細胞ICA在細胞周期中的作用機制不盡相同。本實驗采用不同濃度ICA處理NB4細胞24 h后，G1期細胞比例明顯增多，而S期細胞比例減少，使細胞發(fā)生G1期阻滯，干擾DNA的復制，這可能是ICA抑制NB4細胞增殖的主要機制。

細胞凋亡是由基因調(diào)控的主動死亡過程，是維持器官組織細胞數(shù)量穩(wěn)定和內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的主要機制。細胞凋亡失控是腫瘤過度生長的重要原因，促進細胞凋亡是抗腫瘤治療的方法。多項研究[8-11]表明：ICA可誘導多種腫瘤細胞凋亡。本實驗結(jié)果顯示: NB4細胞經(jīng)不同濃度的(4、8、16、32和64 μmol·L-1)ICA作用48 h后，其凋亡率分別為6.52%、10.07%、15.41%、25.18%和29.41%，與空白對照組比較，各濃度ICA組之間比較差異具有統(tǒng)計學意義，可見ICA對NB4細胞的誘導凋亡作用具有濃度依賴性。本實驗結(jié)果表明：ICA可通過阻滯細胞周期及誘導細胞凋亡抑制NB4細胞增殖。

細胞凋亡途徑分為外源性和內(nèi)源性2條信號通路：外源性途徑即膜表面死亡受體途徑，內(nèi)源性途徑即線粒體途徑。線粒體作為細胞生命活動控制中心，是凋亡的感受器和放大器[12-16]，其中Bcl-2家族對線粒體內(nèi)促凋亡因子的釋放具有調(diào)控功能。Bcl-2家族成員包括Bcl-2/Bax、Bcl-xl/Bcl-xs和Bak等，其相互作用參與細胞凋亡的調(diào)控，其中以Bcl-2/Bax的作用尤為重要[17-19]。國內(nèi)已有多項研究[8-10]證明：ICA可誘導多種腫瘤細胞發(fā)生凋亡，其機制涉及到Bcl-2、Bax和PCNA等多種凋亡相關(guān)蛋白的表達。ICA還可通過上調(diào)細胞內(nèi)活性氧誘導骨肉瘤Saos 2細胞凋亡[11]。本研究結(jié)果顯示：ICA作用NB4細胞48 h后，Bcl-2表達水平下調(diào)，Bax表達水平上調(diào)，Bax/Bcl-2比值增大，提示ICA誘導凋亡作用可能與Bcl-2、Bax蛋白表達改變有關(guān)，推測凋亡涉及到線粒體途徑。

綜上所述，ICA可抑制NB4細胞增殖，并誘導其凋亡。本研究結(jié)果為治療APL的藥物研究提供了新的思路，但目前為止實驗僅局限于體外研究階段，ICA對NB4細胞的體內(nèi)效應(yīng)尚需進一步研究。

[1]葛林埠,董政軍,姜國勝,等.淫羊藿苷對急性早幼粒白血病細胞體內(nèi)外效應(yīng)的研究[J].腫瘤防治雜志,2001,8(6): 622-624.

[2]謝超,董偉,溫培娥.曲古霉素A和淫羊藿甙誘導HL-60細胞分化過程中nm23和c-myc及G-CSF表達變化的研究[J].中華腫瘤防治雜志,2008,15(7): 481-486.

[3]狄凱軍,章靜波.淫羊藿苷與HMBA衍生物單獨及聯(lián)合作用對K562細胞生長的影響及機制研究[J].癌癥進展,2003,1(1): 42-45.

[4]段文飛,蘇繼榮,付小梅,等.淫羊藿苷對胃癌細胞株SGC-7901增殖的影響 [J].中國醫(yī)藥指南,2009,7(24):17-19.

[5]康鄭軍,孫潔,張妍,等.淫羊藿苷對人膀胱癌BIU87細胞GRP78基因表達的影響[J].中醫(yī)學報，2013,28(187): 1792-1793.

[6]張津.淫羊藿苷對前列腺癌LNCaP細胞的作用及其AR相關(guān)分子機制 [D].北京: 北京中醫(yī)藥大學,2013.

[7]顧欣,楊丹丹,王麗,等.淫羊藿甙誘導甲狀腺癌細胞系SW579的分化及惡性表型逆轉(zhuǎn)的實驗研究[J].中國現(xiàn)代普通外科進展,2012,15(7)：505-509.

[8]朱燕輝,黃麗霞,石崇軍.淫羊藿苷對肝癌細胞株SMMC-7721增殖與凋亡的影響 [J].中國普通外科雜志,2012,21(8) : 968-972.

[9]劉得水,陳剛,盧長方,等.淫羊藿苷聯(lián)合絲裂霉素對肝癌HepG2細胞增殖的抑制作用[J].中國生化藥物雜志,2011,32(1): 22-25.

[10]張燁,胡春宏.淫羊藿素對人鼻咽癌細胞CNE-2抑制增殖、誘導凋亡及放射增敏作用的實驗研究[D].長沙：中南大學,2012.

[11]劉玉亮,殷嫦嫦,張義平,等.淫羊藿素抗骨肉瘤的機制研究[J].中成藥,2014,36(1): 4-9.

[12]趙彥超,顧耘.細胞凋亡通路研究進展 [J].現(xiàn)代醫(yī)學,2013,41(4): 285-288.

[13]李敏,林俊.細胞凋亡途徑及其機制[J].國際婦產(chǎn)科學雜志,2014,41(2): 103-107.

[14]Cotter TG.Apoptosis and cancer: the genesis of a research field [J].Nat Rev Cancer,2009,9(2):501-507.

[15]Elmore S.Apoptosis: a review of programmed cell death [J].Toxicol Pathol,2007,35(4):495-519.

[16]Kutuk O,Letai A.Regulation of Bcl-2 family proteins by posttranslational modifications [J].Curr Mol Med,2008,8(2): 102-118.

[17]劉寨新,蘭濤,狄浩然.凋亡抑制基因Bcl-2、Bag-1與腫瘤[J].中國醫(yī)學裝備,2014,11(2): 227-228.

[18]邱野，劉知源，江歆美，等.吉林省臨江市朝鮮淫羊藿苷積累規(guī)律研究[J].吉林中醫(yī)藥，2015，35(5)：502-504.

[19]鄧偉，李新建，田小林，等.紫外分光光度法測定淫羊藿顆粒中淫羊藿苷的含量[J].吉林中醫(yī)藥，2013，33(1)：72-73.

Influence of icaritin in proliferation and apoptosis of NB4 leukemia cells and its mechanism

SONG Fei,GAO Sujun,ZHANG Yunwei,DU Yazhe, WANG Lu,WANG Ruifang,SU Long

(Tumor Center, First Hospital,Jilin University,Changchun 130021,China)

ObjectiveTo investigate the influence of icariin (ICA) on the proliferation and apoptosis of acute promyelocytic leukemia NB4 cells, and to explore its mechanism.Methods The NB4 cells at logarithm growth phase were selected and randomly divided into blank control group,different doses (4，8，16，32，64 μmol·L-1) of ICA groups.Afer the NB4 cells were treated with ICA for different time (24，48，72 h),MTT assay was used to detect the inhibitory rates of NB4 cells,flow cytometry was used to analyze the apoptosis and the cell cycle of the NB4 cells,and the expression levels of apoptosis-associated proteins were detected by Western blotting method.ResultsAfer the cells were cultivated for different time(24，48，72 h),the inhibitory rates of the cells in different doses of ICA groups were higher than those in control group (P<0.05) and they were increased in a dose-and time-dependent manner (P<0.05).The apoptotic rates of NB4 cells in different doses of ICA group 48 h after treatment were (6.52±4.12)%,(10.07±2.36)%,(15.41±3.64)%,(25.18±1.24)% and (29.41±1.43)%,and they were higher than that in control group (2.39%±1.87%) (P<0.05).The flow cytometry results showed that after the cells were cultivated for 24 h in different doses of ICA groups，the number of NB4 cells at S phase was lower than those in control group (P<0.05)，and the number of NB4 cells at G1phase was increased (P<0.05). The expression levels of Bcl-2 in ICA groups were significantly lower than that in control group (P<0.05),while the expression levels of Bax were higher than that in control group (P<0.05).ConclusionICA can induce the apoptosis of NB4 cells via inhibiting the expression level of Bcl-2 and up-regulating the expression level of Bax.

Icaritin;leukemia;NB4 cells;apoptosis

1671-587Ⅹ(2015)06-1181-05

10.13481/j.1671-587x.20150616

2015-08-19

吉林省科技廳自然科學基金資助課題(3D5111013428；2008)

宋飛(1986-)，女，山東省泰安市人，醫(yī)師，醫(yī)學碩士，主要從事血液病的基礎(chǔ)與臨床方面的研究。

高素君，教授，碩士研究生導師(Tel：0431-88782157，E-mail：sujung@sina.com)

R-332；R552

A