馮秋生，闞　泉，呂翠平，李　冉，魏靜波，趙毓芳，甄永占,2

(1． 華北理工大學基礎醫(yī)學院組織學與胚胎學系，河北 唐山063000；2. 華北理工大學基礎醫(yī)學院河北省慢性疾病重點實驗室 河北省唐山市慢性病臨床基礎研究重點實驗室，河北 唐山 063000)

賴氨大黃酸對氧化應激引起的小鼠動脈血管損傷的保護作用及其機制

馮秋生1，闞泉1，呂翠平1，李冉1，魏靜波1，趙毓芳1，甄永占1,2

(1． 華北理工大學基礎醫(yī)學院組織學與胚胎學系，河北 唐山063000；2. 華北理工大學基礎醫(yī)學院河北省慢性疾病重點實驗室 河北省唐山市慢性病臨床基礎研究重點實驗室，河北 唐山 063000)

目的:觀察賴氨大黃酸(RHL)對氧化應激引起的小鼠動脈血管損傷的保護作用，并探討其作用機制。方法：采用腹腔注射百草枯方法建立活性氧引起血管損傷小鼠模型。將30只C57小鼠隨機分為對照組(n=10)、百草枯模型組(n=10)和RHL干預組(n=10)。RHL干預組小鼠在造模前1周灌胃給予RHL，對照組和百草枯模型組灌胃給予等體積蒸餾水。百草枯模型組和RHL干預組腹腔注射百草枯，對照組腹腔注射等體積生理鹽水，每周注射1次，持續(xù)2周。造模2周后檢測血清丙二醛(MDA)水平、超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)活性；DCFH-DA染色觀察血管活性氧水平；HE染色觀察腹主動脈病理表現；Western blotting 法檢測血管損傷相關基因的表達。結果：與對照組比較，百草枯模型組小鼠血管組織小鼠血清SOD和GSH-Px活性下降(P<0.05)，MDA水平升高(P<0.05)；與百草枯模型組比較，RHL干預組MDA水平下降(P<0.05)，SOD和GSH-Px活性升高(P<0.05)；DCFH-DA和HE染色，百草枯模型組小鼠血管組織血管組織活性氧水平升高(P<0.05)，血管結構破壞， RHL干預組血管活性氧水平下降(P<0.05)，病理變化明顯減輕。Western blotting法檢測，與對照組比較，百草枯模型組小鼠血管組織內皮型一氧化氮合酶(eNOS)和caspase-3表達水平降低(P<0.05)，caspase-3裂解片段表達水平升高(P<0.05)；與模型組比較，RHL干預組小鼠血管組織 eNOS和caspase-3 表達水平升高 (P<0.05)，caspase-3裂解片段表達水平降低(P<0.05)。結論：百草枯能夠誘導體內活性氧水平升高引起血管細胞損傷，RHL通過清除活性氧，上調eNOS表達，下調caspase-3裂解片段表達來拮抗百草枯的作用。

賴氨大黃酸；百草枯；活性氧；細胞凋亡

隨著人口老齡化，慢性疾病(如糖尿病和高血壓)的發(fā)病率日益增加。內皮功能損傷在動脈粥樣硬化、糖尿病和原發(fā)性高血壓等慢性疾病的發(fā)生發(fā)展過程中扮演著重要角色。體內氧化物質(如氧化型低密度脂蛋白和一些化合物)參與了內皮功能損傷的病理過程。百草枯(1-1-二甲基-4-4-聯(lián)吡啶二氯化物，paraquat)是一種快速滅生性除草劑，其毒性主要是來源于其代謝產物和氧化還原作用產生的活性氧(ROS)，因此其常被用來誘導體內ROS生成，建立動物體內氧化損傷模型[1-6]。賴氨大黃酸(rhein lysinate,RHL)是本室對大黃酸進行結構改造獲得的具有較好水溶性的化合物，體外研究[7]表明：低劑量(10 μmol·L-1)RHL能夠保護過氧化氫誘導的臍靜脈血管內皮細胞衰老，RHL延緩內皮細胞衰老的作用是通過清除活性氧自由基實現的。本課題組前期研究[8]還發(fā)現：RHL能夠延長快速老化小鼠(SAMP10)的壽命，其延長壽命的作用也與清除活性氧自由基作用有關。但RHL對體內活性氧直接引起的血管內皮細胞損傷是否具有保護作用尚未見報道。本研究采用百草枯建立活性氧引起血管損傷模型，觀察RHL對血管氧化損傷的保護作用，旨在為RHL應用于臨床提供一定的實驗依據。

1　材料與方法

1.1實驗動物、主要試劑和儀器30只C57小鼠，雄性，體質量24～28 g，動物合格證號:SCXK(京)2013-0020，購自中國醫(yī)學科學院動物所，在恒溫(22℃)、相對濕度65%～70%、光照周期12 h∶12 h 環(huán)境中適應飼養(yǎng)1周后用于實驗。RHL由本室合成,分子式為C21H22N2O8，相對分子質量430，純度98%； 百草枯(上海Sigma公司)；超氧化物歧化酶(SOD)測定試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)和丙二醛(MDA)測定試劑盒(南京建成生物工程研究所)；HE染色試劑盒(北京經科宏達生物技術有限公司)；DCFH-DA活性氧檢測試劑盒(上海Sigma公司)；eNOS 和caspase-3抗體(Cell Signaling 公司)；β-actin(SC-16)、辣根過氧化物酶偶聯(lián)二抗(北京中杉金橋公司)。可見光成像系統(tǒng)(日本Olympus公司)，FAITH-4060全自動生化分析儀(中國南京勞拉電子有限公司)，Spectra Max 190酶標儀(美國Molecular Device 公司)，伯樂電泳轉印系統(tǒng)和Quantily One分析軟件(美國Bio-Rad 公司)，Chemilmager 5500 凝膠成像系統(tǒng)(美國Alpha Innotech 公司)。

1.2實驗動物分組及處理將小鼠隨機分為對照組(n=10)、百草枯模型組(n=10)和RHL干預組(n=10)。RHL干預組小鼠在造模前1周灌胃給予RHL(50 mg·kg-1)，每日1次，對照組和百草枯模型組灌胃給予等體積蒸餾水。百草枯模型組和RHL干預組腹腔注射百草枯(10 mg·kg-1)，對照組腹腔注射等體積生理鹽水，每周注射1次，持續(xù)2周。

1.3標本收集小鼠造模2周后，用10%水合氯醛麻醉，右心房采血，分離血清用于測定其MDA水平、SOD和GSH-Px活性。處死小鼠取腹主動脈(主動脈入橫膈處向下1 cm)，一部分置于10% 中性甲醛溶液中固定，用于HE 和DCFH-DA染色，剩余腹主動脈置于液氮中，凍透后轉入-80℃冰箱中用于測定相關蛋白的表達。

1.4血清MDA水平、SOD和GSH-Px 活性測定MDA 水平檢測采用硫代巴比妥酸法，SOD 活力檢測采用聯(lián)苯三酚自氧化法，GSH-Px 活性檢測采用NADPH 偶聯(lián)法。上述檢測均嚴格按照試劑盒說明書操作。

1.5腹主動脈活性氧水平檢測取一段腹主動脈在4℃ 預冷的生理鹽水中反復清洗，置于OCT中包埋，放入液氮上冷卻，-80℃凍存，經冰凍切片機切片后，按照DCFH-DA活性氧檢測試劑盒說明書進行染色，在熒光顯微鏡下觀察紅色活性氧熒光強度，并拍照。

1.6腹主動脈病理學表現10% 中性甲醛固定腹主動脈，常規(guī)石蠟包埋，石蠟切片HE 染色后，顯微鏡下觀察并拍照。

1.7Western blotting法檢測血管損傷相關基因表達水平凍存的腹主動脈加入新鮮配制的組織裂解液(137 mmol·L-1NaCl,20 mmol·L-1Tris，pH 7.4,1% NP40,20% glycerol,10 mmol·L-1PMSF,1 mmol·L-1Na3VO4,10 mmol·L-1NaF,2.5 mg·L-1aprotinin,2.5 mg·L-1leupetin,phosphotase inhibitor cocktail)，4℃下勻漿，冰上裂解15 min， 4℃、12 000 r·min-1離心20 min，取上清，BCA法檢測蛋白濃度。等量蛋白(40 μg)于10% 十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離后，電轉至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜，5%脫脂牛奶 37℃封閉1 h，分別加入抗SIRT1(1∶1 000)、抗p21 (1∶1 000)、抗p16 (1∶1 000)及抗β-actin(1∶2 000)抗體，4℃孵育過夜。洗滌10 min×4次，用含辣根過氧化物酶(HRP) 標記的相應二抗(1∶5 000) 孵育1 h，洗膜15 min×4次，膜上滴加化學發(fā)光增強劑(Santa Cruz biotechnology SC-2048)，按照試劑盒說明書操作，結果在凝膠成像儀上照相并使用Quantity One分析軟件測量條帶吸光度(A)值，目的條帶與β-actin條帶A值比值即為該目的蛋白的相對表達量。

2　結　果

2.1小鼠一般情況和體質量與對照組比較，百草枯模型組小鼠活動減少，進食量減少。RHL干預組小鼠活動量和進食量較正常對照組雖有所下降，但高于百草枯模型組。與對照組[(28.5±1.8)g]比較，百草枯模型組[(25.3±2.8)g]和RHL干預組[(26.2±2.7)g]小鼠體質量下降(P<0.05)。

2.2各組小鼠血清中MDA 水平、SOD 和GSH-Px 的活性與對照組比較，百草枯模型組小鼠血清中SOD 和GSH-Px 活性明顯降低(P<0.05)，MDA 水平明顯升高(P<0.05)。與百草枯模型組比較， RHL干預組小鼠血清中SOD 和GSH-Px 活性明顯升高(P<0.05)，MDA水平明顯降低(P<0.05)。 RHL干預組小鼠血清中SOD水平升高，但與對照組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表1。

2.3DCFH-DA染色檢測各組小鼠血管活性氧水平與對照組比較，百草枯模型組小鼠血管活性氧水平明顯升高。與百草枯氧化損傷模型組比較， RHL干預組小鼠血管活性氧水平明顯下降。見圖1(插頁三)。

2.4各組小鼠腹主動脈病理學表現與對照組比較，百草枯模型組小鼠血管組織可見明顯水腫，內皮細胞中可見氣球樣變性，部分細胞脫落，細胞質顏色嗜堿性，中膜彈性膜增寬、排列松散、間隙增寬。 RHL干預組小鼠以上所述的病理變化明顯減輕。各組小鼠血管組織炎細胞浸潤均不明顯。見圖2(插頁三)。

表1　各組小鼠血清MDA水平和SOD、GSH-Px活性

*P<0.05vscontrol group;△P<0.05vsparaquat model group.

2.5各組小鼠血管組織中eNOS和caspase-3表達與對照組比較，百草枯模型組小鼠血管eNOS和caspase-3表達水平明顯下降(P<0.05)，而剪切后 caspase-3表達水平升高(P<0.05)。與百草枯模型組比較， RHL干預組小鼠血管組織中 eNOS和caspase-3表達水平升高(P<0.05)，剪切后caspase-3表達水平降低(P<0.05)。見圖3和表2。

Lane 1：Control group；Lane 2：Paraquat model group；Lane 3：RHL prevention group.

圖3各組小鼠血管凋亡相關基因表達檢測電泳圖

Fig.3Electrophoregram of expressions of apoptosis-related genes in blood vessel of mice in various groups

表2　各組小鼠血管凋亡相關蛋白的表達水平

CL:Cleaved.*P<0.05vscontrol group;△P<0.05vsparaquat model group.

3　討　論

本課題組前期研究[7]發(fā)現：低劑量RHL能夠清除活性氧自由基，保護臍靜脈內皮細胞免受過氧化氫的損害。目前對于RHL是否能夠清除動物體內產生的活性氧尚未見報道。本研究采用百草枯誘導動物體內氧自由基生成模型，探討RHL是否對活性氧誘發(fā)的血管損傷存在保護作用。百草枯是一種快速滅生性除草劑，其毒性主要是來源于其代謝產物和氧化還原作用產生的活性氧[9-15]。本研究結果顯示：與對照組比較，百草枯模型組小鼠體質量減輕、血清SOD和GSH-Px活性降低，而MDA水平升高；與百草枯模型組比較，RHL干預組血清SOD和GSH-Px活性升高，MDA水平降低。上述結果表明：RHL能夠清除百草枯誘發(fā)的體內活性氧自由基生成。百草枯誘導血清活性氧水平升高，但是否也能誘導血管組織活性氧水平升高受到關注。本研究通過DCFH-DA染色觀察血管活性氧水平結果表明：百草枯模型組血管活性氧水平明顯升高，RHL干預后，活性氧水平明顯降低。同時HE染色顯示：血管組織活性氧水平升高后，出現部分內皮細胞脫落、彈性膜增寬和排列松散等病理變化，應用RHL干預能夠逆轉百草枯對血管組織的損傷。

凋亡在氧自由基誘導細胞損傷中發(fā)揮著重要作用，百草枯所致的氧化應激可誘導血管細胞凋亡。本研究采用Western blotting法檢測在百草枯誘導血管細胞凋亡過程中哪些凋亡信號通路發(fā)生改變及RHL是否能夠通過抗氧化應激作用阻止血管細胞凋亡，結果顯示：百草枯模型組小鼠血管組織中caspase-3表達水平明顯下降，而剪切后caspase-3表達升高。與百草枯模型組比較，應用RHL干預后caspase-3表達水平顯著上調，剪切后caspase-3表達下調，說明caspase-3凋亡蛋白在百草枯誘導血管細胞凋亡和RHL保護血管免受氧化損傷中起著重要作用。本研究同時還顯示：代表血管功能狀況的eNOS表達水平在應用百草枯造模后也降低，而應用RHL干預后能夠逆轉。

總之，RHL能清除活性氧，降低活性氧自由基對血管內皮細胞和彈性膜的損傷。RHL有望成為預防心腦血管疾病的新藥。

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Protective effect of rhein lysinate on blood vessel damage induced by oxidative stress in mice and its mechanism

FENG Qiusheng1,KAN Quan1,LYU Cuiping1,LI Ran1,WEI Jingbo1,ZHAO Yufang1,ZHEN Yongzhan1,2

(1. Department of Histology and Embryology,School of Basic Medical Sciences,North China University of Science and Technology,Tangshan 063000,China;2. Key Laboratory for Chronic Diseases of Hebei Province,Key Laboratory for Preclinical and Basic Research on Chronic Diseases of Tangshan City,School of Basic Medical Sciences,North China University of Science and Technology,Tangshan 063000,China)

ObjectiveTo investigate the protective effects of rhein lysinate (RHL) on the blood vessel damage induced by oxidative stress in the mice,and to explore its mechanism.MethodsThe mouse models of oxidative damage were established by intraperitoneal injection of paraquat.30 C57 mice were randomly divided into control,paraquat model,and RHL prevention groups.The mice in RHL prevention group were given RHL by gavage for one week before performing model.The mice in other two groups were given equal volume of distilled water.For making model,paraquat was intraperitoneally injected in the mice in paraquat model and RHL prevention groups once a week for two weeks.The activities of superoxide dismutase (SOD) and glutathione peroxidase(GSH-Px) and the content of serum malonaldehyde (MDA) of the mice were detected 2 weeks after modeling.The pathological profile of blood vessel was observed by hematoxylin and eosin (HE) staining and the level of reactive oxygen species was observed by DCFH-DA staining.The expressions of genes related to blood vessel damage were detected by Western blotting method.ResultsCompared with control group,the activities of SOD and GSH-Px were decreased and the content of MDA was increased in paraquat model group (P<0.05).Compared with paraquat model group,the activities of SOD and GSH-Px were increased and the content of MDA was decreased in RHL prevention group (P<0.05).The pathological examination indicated the structure of blood vessel of the mice was damaged and the level of reactive oxygen species of blood vessel was increased (P<0.05) in paraquat model group.The pathological changes were significantly improved and the level of reactive oxygen species of blood vessel of the mice was decreased (P<0.05) in RHL prevention group.The Western blotting analysis showed that compared with control group,the expression levels of nitric oxide endothelial synthase (eNOS) and caspase-3 of the mice in paraquat model group were decreased (P<0.05),however the expression level of cleaved fragment of caspase-3 was increased (P<0.05).Compared with paraquat model group,the expression levels of eNOS and caspase-3 of the mice in RHL prevention group were increased (P<0.05) and the expression level of cleaved fragment of caspase-3 was decreased (P<0.05).ConclusionParaquat could induce vascular cell damageinvivothrough increasing the levels of reactive oxygen species,and RHL could antagonize the effects of paraquat by scavenging reactive oxygen species,and up-regulating the eNOS expression and reducing the expression of the cleaved fragment of caspase-3.

rhein lysinate; paraquat; reactive oxygen species; apoptosis

1671-587Ⅹ(2015)06-1171-05

10.13481/j.1671-587x.20150614

2015-02-27

河北省科技廳自然科學基金資助課題(H2012401030)；河北省唐山市科學技術研究與發(fā)展指導計劃項目資助課題(10130267c)

馮秋生(1974-)，男，河北省唐山市人，在讀醫(yī)學碩士，主要從事心腦血管疾病發(fā)病機制和治療方面的研究。

甄永占，副教授，碩士研究生導師(Tel:0315-3725754,E-mail:yongzhanzhen@126.com)

R285.5

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