韓海玲，苗　壯,岳　軍，趙長(zhǎng)福,景遐斌,金順子，王占峰,

(1.吉林大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院 衛(wèi)生部放射生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，吉林 長(zhǎng)春130021；2. 北華大學(xué)附屬醫(yī)院，吉林吉林 132011；3.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院神經(jīng)外2科，吉林 長(zhǎng)春 130033；4.中國(guó)科學(xué)院長(zhǎng)春應(yīng)用化學(xué)研究所 高分子物理與化學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，吉林 長(zhǎng)春 130022 )

鍵合靶向納米膠束對(duì)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的組織相容性和靶向性

韓海玲1，2，苗壯3,岳軍4，趙長(zhǎng)福2,景遐斌4,金順子1，王占峰2,3

(1.吉林大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院 衛(wèi)生部放射生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，吉林 長(zhǎng)春130021；2. 北華大學(xué)附屬醫(yī)院，吉林吉林 132011；3.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院神經(jīng)外2科，吉林 長(zhǎng)春 130033；4.中國(guó)科學(xué)院長(zhǎng)春應(yīng)用化學(xué)研究所 高分子物理與化學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，吉林 長(zhǎng)春 130022 )

目的：探討轉(zhuǎn)鐵蛋白受體的單克隆抗體(OX26)與聚乳酸聚乙二醇(PEG-PLA)鍵合靶向納米膠束(copolymer/OX26)的生物相容性和安全性，闡明其作為腦膠質(zhì)瘤靶向治療載體的可行性。方法：體外培養(yǎng)C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞，用不同濃度(10.0、20.0、40.0和80.0 mg·L-1)納米膠束作為實(shí)驗(yàn)組，不含膠束的培養(yǎng)液作為對(duì)照組；臺(tái)盼藍(lán)染色法檢測(cè)靶向納米膠束對(duì)膠質(zhì)瘤C6細(xì)胞的增殖抑制作用；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)靶向納米膠束作用后C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期變化；激光共聚焦顯微鏡觀察腫瘤細(xì)胞對(duì)靶向膠束的攝入情況。結(jié)果：與對(duì)照組比較，OX26靶向納米膠束作用后C6細(xì)胞數(shù)無(wú)明顯改變(P>0.05)， 各組細(xì)胞凋亡率和細(xì)胞周期細(xì)胞比例差異亦無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；靶向納米膠束組細(xì)胞內(nèi)的熒光強(qiáng)度明顯高于空白膠束組和空白對(duì)照組(P<0.05)，并且這種作用隨藥物作用時(shí)間和濃度的增加而增加。結(jié)論：OX26靶向納米膠束對(duì)C6細(xì)胞增殖和凋亡無(wú)影響，鍵合OX26提高了C6細(xì)胞對(duì)膠束的攝入量。

神經(jīng)膠質(zhì)瘤；靶向納米膠束；轉(zhuǎn)鐵蛋白受體；組織相容性

腦膠質(zhì)瘤是顱內(nèi)常見腫瘤，發(fā)病率占顱內(nèi)腫瘤的40%。紫杉醇(paclitaxel， PTX)等多種一線新型抗腫瘤藥物對(duì)治療多種腫瘤有效，但因血腦屏障的存在限制其在顱腦疾病中的應(yīng)用[1-2]。因此，尋找有效的藥物載體成為目前腦膠質(zhì)瘤化學(xué)治療研究的熱點(diǎn)。研究[3]表明:轉(zhuǎn)鐵蛋白受體(transferring recepter,TfR)存在于腦BBB細(xì)胞壁上，借助TfR介導(dǎo)的內(nèi)吞途徑，轉(zhuǎn)鐵蛋白(transferrin，Tf)能順利通過(guò)BBB細(xì)胞。但Tf是血漿中主要的含鐵蛋白質(zhì)之一，且與BBB細(xì)胞上TfR的結(jié)合接近飽和，留給外源藥物——Tf復(fù)合物的機(jī)會(huì)很少。因此Tf自身不適于作為藥物轉(zhuǎn)運(yùn)載體。研究者利用分子生物學(xué)手段，制備出多種TfR的單克隆抗體，如OX26就是其中之一，其與TfR能發(fā)生特異性地識(shí)別和結(jié)合，借助于TfR介導(dǎo)的內(nèi)吞途徑，OX26能順利通過(guò)BBB細(xì)胞。而且，OX26與TfR的結(jié)合位點(diǎn)不同于Tf與TfR的結(jié)合位點(diǎn)，因而OX26和Tf間不存在互相競(jìng)爭(zhēng)和抑制，大量?jī)?nèi)源Tf的存在不影響對(duì)OX26/藥物復(fù)合物的轉(zhuǎn)運(yùn)。因此有研究者[4-5]用OX26作為藥物載體，向中樞神經(jīng)系統(tǒng)轉(zhuǎn)運(yùn)藥物。本課題組率先與中國(guó)科學(xué)院長(zhǎng)春應(yīng)用化學(xué)研究所景遐斌研究員合作，通過(guò)化學(xué)鍵合的方法，將轉(zhuǎn)鐵蛋白受體單克隆抗體OX26與PEG-PLA鍵合成靶向納米膠束(copolymer/OX26)，有望改變傳統(tǒng)化療藥物的理化特性，其作為腦靶向藥物載體具有廣闊的應(yīng)用前景。目前，關(guān)于納米材料的生物安全性、生物效應(yīng)及對(duì)人體健康的潛在影響也逐漸受到重視[6]。因此，本研究從OX26-聚乳酸聚乙二醇(PEG-PLA)納米膠束對(duì)腦膠質(zhì)瘤靶細(xì)胞的影響及生物學(xué)效應(yīng)方面進(jìn)行探討，為鍵合靶向納米膠束作為顱腦腫瘤靶向藥物載體的生物效應(yīng)及安全性進(jìn)行分析，為進(jìn)一步臨床應(yīng)用奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1細(xì)胞、主要試劑和儀器大鼠C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞系(C6細(xì)胞)由吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室提供。培養(yǎng)基：RPMI 1640 (Sigma公司， 美國(guó)) + 10% (體積比)熱滅活小牛血清 + 青霉素100 U·mL-1+ 鏈霉素100 U·mL-1,pH為7.2～7.3,過(guò)濾消毒。小牛血清為杭州四季青生物材料有限公司產(chǎn)品。青霉素和鏈霉素由華北制藥廠生產(chǎn)?；瘜W(xué)鍵合紫杉醇即PEG-PLA/PTX自制：10 mg PEG-PLA/PTX溶解于5 mL DMF 中，置于透析袋中,用1 000 mL 二次蒸餾水透析24 h，每4 h更換1次雙蒸水。透析完成后離心，取上清，冷凍干燥，置4℃保存?；旌夏z束表面鍵合單克隆抗體(OX26)：首先利用Trauts試劑在抗體上引入自由巰基，然后巰基化的抗體與表面含馬來(lái)酰亞胺的混合膠束在溫和條件下通過(guò)Michael加成反應(yīng)固定在膠束表面(中國(guó)科學(xué)院長(zhǎng)春應(yīng)用化學(xué)研究所提供)。原料藥紫杉醇購(gòu)自西安寶賽生物科技有限公司。二氯甲烷(DCM)為分析純，購(gòu)自北京化工廠。乙腈為色譜純，購(gòu)自上海復(fù)旦化學(xué)試劑有限公司。二次蒸餾水，使用SZ-93型自動(dòng)雙重純水蒸餾器(上海亞榮生化儀器廠)制備。磷酸鹽緩沖溶液(PBS)，配制濃度為0.01 mol·L-1(pH7.4)。透析袋為醋酸纖維素材質(zhì)，截流相對(duì)分子質(zhì)量35 000。FV 1000型共聚焦激光掃描顯微鏡(CLSM)。

1.2臺(tái)盼藍(lán)染色實(shí)驗(yàn)消化對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的C6細(xì)胞，制成2×105mL-1細(xì)胞懸液，接種于96孔培養(yǎng)板，每孔100 μL懸液(2×104個(gè)細(xì)胞)，分別加入200 μL濃度為0(空白對(duì)照組)、10、20、40和80 mg·L-1的空白OX26-PEG-PLA(相當(dāng)于PTX濃度為0、10.0、20.0、40.0和80.0 mg·L-1)/RPMI 1640溶液，培養(yǎng)1、2、3、4和5 d，采用臺(tái)盼藍(lán)染色法檢測(cè)各組的細(xì)胞數(shù)，觀察載體材料OX26-PEG-PLA的細(xì)胞毒性。

1.3流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期消化C6細(xì)胞，以5×105mL-1細(xì)胞懸液接種25 cm2培養(yǎng)瓶，24 h后更換培養(yǎng)液，分別加入PTX濃度為0、40.0和80.0 g·mL-1濃度的OX26-PEG-PLA膠束/RPMI 1640溶液，此時(shí)間點(diǎn)被稱為第0天。在第3天分別收集各組細(xì)胞，加入0.5 mL冰冷的70%乙醇中， -20℃冰箱保存。將制備好的單細(xì)胞懸液以1 000 r·min-1離心10 min,棄去固定液，冷PBS漂洗2次(1 000 r·min-1,5 min)，調(diào)整細(xì)胞為1×109L-1，加入PI染液1.0 mL，避光染色30 min，上機(jī)分析，用ModFit 軟件收集、貯存和分析數(shù)據(jù)，獲得各組細(xì)胞的凋亡率和各細(xì)胞周期的細(xì)胞分布情況。見表1。

1.4激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)標(biāo)記的膠束與C6細(xì)胞作用后細(xì)胞內(nèi)的熒光強(qiáng)度用1% PBS緩沖液沖洗預(yù)先接種在蓋玻片上的C6細(xì)胞3次，加1.25 mg·L-1熒光標(biāo)記膠束(由中國(guó)科學(xué)院長(zhǎng)春應(yīng)用化學(xué)研究所制備)，各組分別為：空白對(duì)照組、空白膠束、OX26-PEG-PLA-DHC/20 mg·L-1、OX26-PEG-P(LA-DHC/40 mg·L-1)，37℃避光孵育特定時(shí)間，洗滌細(xì)胞，3.7%多聚甲醛固定12 min,PBS洗片,50 μL PBS/甘油混合溶液(體積比1∶1)封片。激光共聚焦顯微鏡下觀察(TRITC的激發(fā)波長(zhǎng)為550 nm，發(fā)射波長(zhǎng)620 nm) 。

2　結(jié)　果

2.1C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞形態(tài)學(xué)倒置顯微鏡觀察可見腫瘤活細(xì)胞形態(tài)基本一致：經(jīng)80 mg·L-1空白納米膠束處理72 h的細(xì)胞可見細(xì)胞排列整齊，細(xì)胞大小形態(tài)趨向一致。與對(duì)照組比較,細(xì)胞核/質(zhì)比例無(wú)明顯變化。見圖1。臺(tái)盼藍(lán)染色結(jié)果：納米膠束作用后，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組細(xì)胞數(shù)比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。10、20、40和80 mg·L-1濃度的各空白OX26-PEG-PLA處理組細(xì)胞數(shù)隨著時(shí)間的增加而增加，與空白對(duì)照組細(xì)胞數(shù)相似；與對(duì)照組和作用1 d比較，作用5 d各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞明顯增殖(P<0.05)，但各實(shí)驗(yàn)組間兩兩比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

A：Control group (24 h);B：80 mg·L-1copolymer micelles group (24 h)；C：Control group (72 h); D：80 mg·L-1copolymer micelles group (72 h).

圖1倒置顯微鏡觀察各組C6細(xì)胞形態(tài)學(xué)表現(xiàn)(×200)

Fig.1Morphology of C6 glioma cells in various groups observed with inverted microscope (×200)

2.2各組細(xì)胞凋亡率和細(xì)胞周期變化40 mg·L-1PEG-PLA、10和40 mg·L-1OX26膠束作用72 h后,C6細(xì)胞凋亡率與對(duì)照組比較未見明顯改變(P>0.05)。與對(duì)照組比較，OX26-PEG-PLA-DHC/作用后G0/G1、S和 G2/M細(xì)胞周期的C6細(xì)胞比例未見明顯改變(P>0.05)。見表2。

表1　各組不同時(shí)間C6細(xì)胞數(shù)

表2　各組C6細(xì)胞凋亡率和細(xì)胞周期

2.3各組C6細(xì)胞對(duì)熒光標(biāo)記膠束的攝入量激光共聚焦顯微鏡下觀察熒光情況并計(jì)算熒光強(qiáng)度值，如表3所示。靶向膠束作用2 h的熒光強(qiáng)度高于作用1 h(P<0.05)；40 mg·L-1組強(qiáng)度明顯高于20 mg·L-1組(P<0.05)；靶向膠束組熒光強(qiáng)度明顯高于膠束組(P<0.05)。

表3各組C6細(xì)胞中攝入藥物的熒光強(qiáng)度

*P<0.05 compared with 1 h;△P<0.05 compared with OX26-PEG-PLA-DHC/PTX/20 group;#P<0.05 compared with PEG-PLA-DHC/PTX/40 group.

3　討　論

研究[7-8]表明:由于血腦屏障的存在限制了化療藥物在腦腫瘤治療中的應(yīng)用。紫杉醇作為目前治療多種腫瘤有效的一線化療藥物，由于其溶解度低，透過(guò)血腦屏障差限制了其在腦膠質(zhì)瘤治療中的應(yīng)用。藥物如何透過(guò)血腦屏障成為目前研究熱點(diǎn)。

納米膠束(粒徑一般小于100 nm)作為一種新型藥物釋放載體，具有粒徑分布均勻、載藥范圍廣、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、體內(nèi)滯留時(shí)間長(zhǎng)、載藥量高和可透過(guò)血腦屏障等獨(dú)特的體內(nèi)分布特點(diǎn)，同時(shí)可通過(guò)表面修飾鏈接不同靶向基元，實(shí)現(xiàn)膠束藥物的腫瘤靶向作用。作為理想的靶向載藥納米材料應(yīng)具有鍵合藥物包封率高、擔(dān)載藥物能夠滿足治療的需要、較強(qiáng)靶向性、組織相容性好和易控制的藥物釋放過(guò)程[9-10]等特點(diǎn)。

本研究制備的納米膠束具有抗癌藥增容(PTX在水中的溶解度約1 mg·L-1)、抗癌藥保護(hù)和可控釋放，將PTX包裹在膠束的芯層，OX26處于膠束的最外層。靶向基元在外面是實(shí)現(xiàn)靶向的需要，但是OX26是一種蛋白質(zhì)，在血液環(huán)境和組織環(huán)境中，容易受到人體免疫系統(tǒng)的攻擊，被攔截， 甚至被清除，所以將OX26鍵合在聚合物的疏水端(段),得到PEG-PLA-OX26，由于OX26是親水的，相當(dāng)于一個(gè)三嵌段聚合物,使OX26受到PEG鏈段的保護(hù)，但OX26仍然處在水環(huán)境中，可與TfR接觸，保持靶向功能。為了調(diào)節(jié)OX26在納米膠束中的位置，擬選用不同長(zhǎng)度的間隔基(spacer)將OX26鍵合在PEG-PLA的親水端，即形成OX26-PEG-PLA和(或)OX26-PEG-PLA-PTX 2種鍵合物，實(shí)現(xiàn)對(duì)OX26蛋白質(zhì)的保護(hù)，又不妨礙OX26靶向功能的發(fā)揮[11-12]。

本研究通過(guò)將轉(zhuǎn)鐵蛋白受體單克隆抗體OX26作為靶向基元，PEG-PLA為載體構(gòu)建擔(dān)載紫杉醇的靶向納米膠束，利用OX26介導(dǎo)的內(nèi)吞，將抗癌藥物送入膠質(zhì)瘤細(xì)胞，通過(guò)激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)證實(shí)OX26可提高膠質(zhì)瘤對(duì)納米膠束的攝入量，從而實(shí)現(xiàn)將化療藥物輸送到腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)嚴(yán)格意義上的腦膠質(zhì)瘤的瘤細(xì)胞靶向。通過(guò)MTT檢測(cè)證實(shí)：OX26靶向納米膠束對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖無(wú)影響，未見明顯不良反應(yīng)，表明OX26-PEG-PLA-DHC納米膠束對(duì)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)無(wú)影響。細(xì)胞凋亡是通過(guò)基因調(diào)控的細(xì)胞自殺現(xiàn)象,在正常組織分化和腫瘤治療中具有重要意義,腫瘤的治療在某種程度上就是誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的過(guò)程[13-14]?？鼓[瘤藥物的抑瘤作用多是通過(guò)減少細(xì)胞的有絲分裂、促進(jìn)細(xì)胞凋亡實(shí)現(xiàn)。本研究中流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果表明：膠束含量的增加對(duì)腫瘤細(xì)胞的凋亡率和細(xì)胞周期無(wú)影響。理想的腫瘤靶向藥物除具有良好的細(xì)胞相容性，還應(yīng)具有良好的細(xì)胞靶向性，激光共聚焦檢測(cè)顯示：鍵合轉(zhuǎn)鐵蛋白受體單克隆抗體(OX26)后能明顯提高C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞對(duì)膠束的靶向攝入[14-16]。

綜上所述，通過(guò)鍵合的方法將轉(zhuǎn)鐵蛋白受體單克隆抗體-OX26鍵合到PEG-PLA 作為骨架的納米膠束上，可增加細(xì)胞對(duì)藥物的攝入量，且空白膠束對(duì)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖無(wú)明顯影響，有較好的生物相容性，可能成為腫瘤細(xì)胞靶向治療載體。

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Biocompatibility and brain-targeting ability of nano-micelles on glioma cells

HAN Hailing1，2, MIAO Zhuang3,YUE Jun4,ZHAO Changfu2,JING Xiabin3，JIN Sunzi1,WANG Zhanfeng2,3

(1.Key Laboratory of Radiobiology,Ministry of Health School of Public Health,Jilin University,Changchun 130021,China; 2.Affliatted Hospital, Beihua University,Jilin 132011,China;3.Department of Neurosurgery,China-Japan Union Hospital,Jilin University,Changchun 130033,China;4.State Key Lab of Polymer Physics and Chemistry,Changchun Institute of Applied Chemistry, Changchun 130022,China)

ObjectiveTo investigate the biocompatibility and safety of nanoscale brain-targeting-carrier micelles[poly(ethylene)-b-poly(lactic acid) /OX26 conjugate micells(copolymer/OX26)],and to explore its possibility as brain-targeted-drug carrier for brain glioma.MethodsThe C6 glioma cells were culturedinvitroand divided into experimental groups with different concentrations (10,20,40，80 mg·L-1) of nano micelle,and the medium without micelle was used as control group.The inhibitory effect of nano-micelles on the rat brain glioma C6 cells was examined by Trypan blue cell counting assay.Flow cytometry (FCM) was used to detect the changes of apoptosis and cell cycle of C6 cells,and confocal laser scanning microscope (CLSM) was performed to analyze the distribution of copolymer/OX26 into C6 cells.ResultsThe results of Trypan blue cell counting assay showed copolymer/OX26 didn’t affect the growth of C6 cells,and there were no significant differences in the number of C6 cells between control group and expreimental groups(P>0.05).The results of FCM showed that the cell cycle and and the apoptotic rates of C6 cells had no changes compared with control group(P>0.05).The results of CLSM showed that the fluorescence intensities in experimental groups were higher than those in blank micelles group and blank control group(P<0.05),and they were increased in dose- and time-dependent manner(P<0.05).ConclusionCopolymer/OX26 has no effect on the growth and apoptosis of glioma cells.By bonding OX26, copolymer/OX26 can significantly increase the intake of C6 cells on the nano micelles.

glioma; brain-targeting-carrier micelles;transferrin receptor;histocompatibility

1671-587Ⅹ(2015)06-1134-05

10.13481/j.1671-587x.20150607

2015-05-05

國(guó)家自然科學(xué)基金資助課題(20904002)；教育部新世紀(jì)優(yōu)秀人才計(jì)劃項(xiàng)目資助課題(NCET-10-0171)；吉林省科技廳青年基金資助課題(20130522020JH)；吉林省高技術(shù)產(chǎn)業(yè)發(fā)展專項(xiàng)資助課題(JF2012C005-2)；吉林省教育廳十一五重大課題(2009139)；吉林大學(xué)白求恩醫(yī)學(xué)科研支持計(jì)劃項(xiàng)目資助課題(2013107027)

韓海玲(1977-)，女，吉林省松原市人，副主任醫(yī)師，在讀醫(yī)學(xué)博士，主要從事腦血管病的生物治療和基礎(chǔ)方面的研究。

王占峰，副主任醫(yī)師，碩士研究生導(dǎo)師(Tel：0431-84995718，E-mail：1206hhl@sina.com)

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