趙揚揚，張 良，，霍丹群，* ，楊 平，秦 輝，侯長軍，敖宗華，胡曉燕，蔡小波，涂榮坤

(1.重慶大學，生物工程學院，重慶400030;2.瀘州老窖股份有限公司，四川瀘州646000;3.國家固態(tài)釀造工程技術(shù)研究中心，四川瀘州646000;4.四川理工學院，四川自貢643000)

固態(tài)發(fā)酵法是中國白酒的傳統(tǒng)生產(chǎn)方法，其漫長的發(fā)酵過程形成了白酒獨特的風味特征［1－2］。在生產(chǎn)實踐中雖然每口窖池的出酒率及優(yōu)質(zhì)酒率均存在差異，但通過研究生產(chǎn)較為穩(wěn)定的窖內(nèi)各種物質(zhì)變化情況，摸索窖內(nèi)物質(zhì)轉(zhuǎn)化趨勢、規(guī)律，可以為白酒生產(chǎn)在線監(jiān)測和工藝調(diào)控提供有效數(shù)據(jù)。

白酒生產(chǎn)過程中封窖的目的是為窖內(nèi)糟醅微生物代謝提供一種有利于產(chǎn)酒、產(chǎn)香的厭氧環(huán)境。傳統(tǒng)封窖方式為糟醅入滿窖后在面糟表面封一層窖泥，來達到封窖的目的。但實際生產(chǎn)中由于封窖窖泥直接與外界接觸，水分散失快且窖泥表面易出現(xiàn)裂縫易污染雜菌，無法保持糟醅微生物發(fā)酵所需的厭氧環(huán)境。此外，窖內(nèi)微生物代謝過程產(chǎn)生的氣體容易沖破窖泥，破壞窖內(nèi)厭氧環(huán)境［3］。新型封窖方式采用不銹鋼材料作為發(fā)酵窖池蓋子，既能夠減少水分散失又能夠避免雜菌污染保證厭氧環(huán)境，從而很好地解決了這一問題。通過對比研究傳統(tǒng)封窖方式與新型封窖方式發(fā)酵過程中窖內(nèi)糟醅微生物數(shù)量變化情況及理化指標的變化、原酒出酒率、乳己比、雜醇油含量變化，在保證提高原酒質(zhì)量及產(chǎn)量的情況下，為推動白酒產(chǎn)業(yè)由人工操作向機械化生產(chǎn)發(fā)展奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

窖池 瀘州老窖股份有限公司羅漢釀酒基地同一生產(chǎn)車間窖齡相同的數(shù)口窖池進行實驗(生產(chǎn)數(shù)據(jù)采集9～12月)，新型封窖方式選用不銹鋼蓋子進行封窖［4］，對照窖池選用傳統(tǒng)窖泥進行封窖;糟醅 正常生產(chǎn)糟醅，理化指標基本一致。

氣相色譜分析儀器GC－7890A U.S.Agilent;分析天平 梅特勒－托利多儀器有限公司;超純水機 重慶摩爾水處理有限公司;電爐 北京市永光明醫(yī)療儀器廠。

1.2 實驗方法

選取數(shù)口封窖高度相同的實驗窖池，封窖高度為100 cm。用自制取樣器對其發(fā)酵過程進行跟蹤取樣。根據(jù)入窖后實驗窖內(nèi)的溫度變化，擬定取樣時間為:第 0(入窖)、7、14、21、28、35、42、49、56、64 d(出窖)。

跟蹤檢測糟醅理化指標:酸度、淀粉含量、還原糖、糟醅殘留酒精含量［5－8］及糟醅殘留特征組分的變化。起窖時分層取二段綜合原酒酒樣，運用酸堿中和滴定法測其總酸［9］，皂化反應滴定法測其總酯［10］、特征組分及雜醇油［11］，并對相應窖池進行出酒率、優(yōu)質(zhì)酒率評定。糟醅特征組分檢測［12］，各監(jiān)測數(shù)據(jù)均為實驗窖池對應樣品的3次平均值。

培養(yǎng)條件及方法［10］:酵母菌和霉菌采用虎紅瓊脂培養(yǎng)基;細菌與芽孢桿菌采用營養(yǎng)瓊脂糖培養(yǎng)基。酵母菌28℃恒溫培養(yǎng)2～3 d，霉菌32℃恒溫培養(yǎng)2～3 d，細菌與芽孢桿菌37℃恒溫培養(yǎng)2～3 d。

微生物計數(shù)方法［10］:首先點清每個平皿板子上的生長的菌落數(shù)，再求出來每一個稀釋度的平均的菌落數(shù)。判定結(jié)果的時候，應該選取平皿板子上菌落數(shù)目既清析可數(shù)，平均數(shù)目又在5～50范圍之內(nèi)的菌落數(shù)目，乘以其稀釋的倍數(shù)后，做為實驗樣品所對應的菌落的總數(shù)。

相關(guān)公式:出酒率(%)=出酒量/投糧量×100;菌量整體變化趨勢為傳統(tǒng)封窖方式不同發(fā)酵時期窖內(nèi)相應微生物數(shù)量變化趨勢。

感官品評:參考國家標準［13］《白酒分析方法GB/T 10345－2007》進行由5位(其中2位國家級白酒評委)省級及以上白酒評委對數(shù)口窖池原酒進行評級。采取編號暗評法，按照色5分、香25分、味60分、格10分、總分100分進行綜合評定，各評委所打分數(shù)求平均值，即為該樣品所得分。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵過程中糟醅微生物含量變化趨勢

2.1.1 可培養(yǎng)細菌數(shù)量變化趨勢 在發(fā)酵過程中，影響細菌數(shù)量變化的主要因素為溶氧量［14］。研究發(fā)現(xiàn)新型封窖方式與傳統(tǒng)封窖方式同一時期不同層次的糟醅可培養(yǎng)細菌數(shù)量相差不大。

對比兩種封窖方式面糟中，不同發(fā)酵時期可培養(yǎng)細菌數(shù)量相差甚微。中下層可培養(yǎng)細菌數(shù)量在第7 d時兩種封窖方式有顯著差異(p＜0.05)，在第14、21 d時表現(xiàn)為新型封窖方式＞傳統(tǒng)封窖方式，而后兩種封窖方式內(nèi)可培養(yǎng)細菌數(shù)量相差不大。前者可能是由于隨著發(fā)酵過程中的進行，窖內(nèi)糟醅會出現(xiàn)不同程度下陷現(xiàn)象，采用窖泥封窖方式時窖帽會隨著糟醅向下略移，造成窖內(nèi)糟醅之間空隙較少，溶氧量下降，而不銹鋼封窖方式的窖帽則不會出現(xiàn)這種情況，它能夠保證窖內(nèi)糟醅之間有足夠的空間，便于物質(zhì)能量傳遞的同時也增加了窖內(nèi)溶氧量，更利于微生物生長。后者可能因為此時影響細菌生長代謝的決定因素已經(jīng)不再是溶氧量，可能是包括可利用底物含量和低些產(chǎn)物積累量等因素在內(nèi)的窖內(nèi)環(huán)境。

圖1 發(fā)酵過程中面糟細菌數(shù)量變化趨勢Fig.1 Bacteria growth curve during fermentation process of the upper distilled grains

2.1.2 可培養(yǎng)酵母菌數(shù)量變化趨勢 發(fā)酵過程中酵母菌數(shù)量的多少與窖內(nèi)酒精濃度關(guān)聯(lián)緊密，如圖3和圖4所示，酵母菌數(shù)量在第7 d均出現(xiàn)峰值，而后逐漸較少。面糟在第35 d、中下層糟醅在第21 d出現(xiàn)第二個峰值，而后逐漸減少。說明中下層糟醅比面糟更早進入無氧發(fā)酵，酵母菌先進行有氧繁殖而后進行厭氧生長。

圖2 中下層糟醅發(fā)酵過程中細菌變化趨勢Fig.2 Bacteria growth curve during fermentation process of thelower distilled grains

圖3 發(fā)酵過程中面糟酵母菌數(shù)量變化趨勢Fig.3 Yeast growth curve during fermentation process of the upper distilled grains

圖4 發(fā)酵過程中中下層酵母菌數(shù)量變化趨Fig.4 Yeast growth curve during fermentation process of the lower distilled grains

由圖可知:在同一窖池不同發(fā)酵時期酵母菌數(shù)量不同，這與發(fā)酵過程中前期糟醅之間溶氧量、窖池內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)及代謝產(chǎn)物有關(guān)。不同窖池同一發(fā)酵時期，新型封窖方式窖池內(nèi)酵母菌數(shù)量略高于傳統(tǒng)窖池內(nèi)酵母菌數(shù)量，這可能與發(fā)酵過程中糟醅之間的溶氧量有關(guān)，與中下層糟醅可培養(yǎng)細菌的變化原因相同。糟醅中酵母菌數(shù)量變化與窖池內(nèi)乙醇含量密切相關(guān)［15］。

2.1.3 可培養(yǎng)霉菌數(shù)量變化趨勢 發(fā)酵過程中窖池內(nèi)霉菌數(shù)量在第7 d均出現(xiàn)峰值，而面糟在第28 d，中下層糟醅在第42 d出現(xiàn)第二個峰值。

圖5 發(fā)酵過程中面糟霉菌數(shù)量變化趨勢Fig.5 Mould growth curve during fermentation process of the upper distilled grains

圖6 發(fā)酵過程中中下層霉菌數(shù)量變化趨勢Fig.6 Mould growth curve during fermentation process of the lower distilled grains

由圖可知:同一時期，不同窖池內(nèi)霉菌數(shù)量不同，這與窖池內(nèi)溶氧量有關(guān)，其原因與細菌、酵母菌在發(fā)酵后期數(shù)量變化原因相同。面糟在第14、28、42、49 d時兩種封窖方式有顯著差異(p＜0.05)。中下層糟醅在第14、28、35、49、56 d 時兩種封窖方式有顯著差異(p＜0.05)。同一窖池內(nèi)不同時期，霉菌數(shù)量亦不相同，這與窖內(nèi)溶氧量、營養(yǎng)物質(zhì)的消耗及代謝物質(zhì)的積累有關(guān)。

霉菌出現(xiàn)第二次峰值對應可培養(yǎng)細菌的減少時期，表明此時窖內(nèi)溶氧量已經(jīng)基本消耗殆盡。大部分霉菌已基本死亡，但仍以孢子形式存在。檢測到的霉菌是由于培養(yǎng)過程中孢子壁破裂，釋放出來所致［16］。

2.2 發(fā)酵過程中各項理化指標變化

2.2.1 發(fā)酵過程中糟醅淀粉含量變化 傳統(tǒng)封窖方式與新型封窖方式窖池發(fā)酵過程中糟醅淀粉含量變化如圖7所示:

由圖7、圖8可知:面糟淀粉含量在入窖、35、42、49、56、64 d時兩種封窖方式在p＜0.05水平上有顯著差異，前21 d下降最快，第28 d時出現(xiàn)略微上升而后緩慢下降。前者可能是曲藥中的淀粉酶及入窖糟醅中的霉菌、好氧細菌生長分解大部分淀粉;后者可能是窖池內(nèi)的兼性厭氧細菌的生長產(chǎn)生的淀粉酶，這與張文學［17］、周瑞平［18］等人的研究結(jié)果相似。中下層糟醅淀粉含量在入窖時兩種封窖方式有顯著差異(p＜0.05)，在第14 d以后直至63 d出窖兩種封窖方式有極顯著差異(p＜0.05)。值得注意的是，中下層糟醅淀粉含量在第21 d出現(xiàn)略微上升趨勢?？赡苁且驗榘l(fā)酵產(chǎn)生水的下淋作用，把可溶性的還原糖帶到了底層，使得底層糟醅的還原糖增加(淀粉的檢查包含了還原糖在內(nèi)的)，導致淀粉含量略有上升，但是發(fā)酵過程中面糟沒有得到補給。

圖7 發(fā)酵過程中面糟淀粉含量變化Fig.7 Changes of starch content during fermentation process of the upper distilled grains

圖8 發(fā)酵過程中中下層糟醅淀粉含量變化Fig.8 Changes of starch content during fermentation process of the lower distilled grains

2.2.2 發(fā)酵過程中糟醅還原糖含量變化 傳統(tǒng)封窖方式與新型封窖方式發(fā)酵過程中糟醅還原糖含量變化如圖9、圖10所示:

圖9 發(fā)酵過程中面糟還原糖含量變化Fig.9 Changes of reducing sugar content during fermentation process of the upper distilled grains

由圖9、圖10可知:面糟發(fā)酵前7 d還原糖含量出現(xiàn)上升趨勢，在第7、42、56 d時兩種封窖方式差異性顯著(p＜0.05)。這與面糟淀粉含量變化相對應，微生物以淀粉為碳源進行代謝生成還原糖等物質(zhì)。而中下層糟醅在入窖、7、42、49 d時兩種封窖方式差異性顯著(p＜0.05)，在第14 d出現(xiàn)上升，第21～28 d出現(xiàn)大幅度下降，而后緩慢上升。前14 d上升是因為微生物以淀粉為主要碳源進行代謝，產(chǎn)生大量中間產(chǎn)物(還原糖)。第21 d下降是因為隨著好氧菌的死亡，酵母菌生長消耗大量還原糖所致，這與淀粉含量變化相對應。面糟、中下層糟醅在第28 d出現(xiàn)上升是由于微生物代謝的消耗量小于代謝產(chǎn)生量所致。

圖10 發(fā)酵過程中中下層糟醅還原糖含量Fig.10 Changes of reducing sugar content during fermentation process of the lower distilled grains

2.2.3 發(fā)酵過程中糟醅殘留酒精含量變化 傳統(tǒng)封窖方式與新型封窖方式發(fā)酵過程中糟醅還原糖含量變化如圖11、圖12所示:

圖11 發(fā)酵過程中面糟酒精度含量變化趨勢Fig.11 Changes of alcoho content during fermentation process of the upper distilled grains

圖12 發(fā)酵過程中中下層糟醅酒精度含量變化Fig.12 Changes of alcoho content during fermentation process of the lower distilled grains

由圖11、圖12可知:各層次糟醅酒精度數(shù)均在第21 d上升到最大值，發(fā)酵過程中糟醅殘留酒精度:新型封窖方式＞傳統(tǒng)封窖方式，這與窖池內(nèi)酵母菌數(shù)量有關(guān)，同時也說明新型封窖方式更適合于酵母菌的繁衍。而從第28 d開始各層次乙醇含量均出現(xiàn)下降趨勢，可能和乙醇參與各類酯化反應及作為微生物代謝所需碳源有關(guān)。這與發(fā)酵后期窖內(nèi)糟醅酸度和總酯的增加相對應，同時也印證了發(fā)酵后期窖內(nèi)發(fā)酵以酯化作用為主的傳統(tǒng)認識。

2.2.4 發(fā)酵過程中糟醅酸度變化 傳統(tǒng)封窖方式與新型封窖方式發(fā)酵過程中糟醅酸度含量變化如圖13、圖14所示:

圖13 發(fā)酵過程中面糟酸度含量變化趨勢Fig.13 Changes of acidity content during fermentation process of the upper distilled grains

圖14 發(fā)酵過程中中下層酸度含量變化趨勢Fig.14 Changes of acidity content during fermentation process of the lower distilled grains

由圖13、圖14可知:面糟在第24、49 d時兩種封窖方式差異性顯著(p＜0.05)，在第 35、42、56、63 d兩種封窖方式差異性極顯著(p＜0.05)。中下層糟醅在第21、49 d時兩種封窖方式有顯著差異性，在第28、35、42、56、63 d 時兩種封窖方式差異性極顯著(p＜0.05)。各層糟醅酸度前42 d均出現(xiàn)逐漸上升趨勢，直至第21 d以后各層次糟醅酸度均出現(xiàn)下降趨勢。下降的原因可能與窖池中的酸參加酯化反應有關(guān)。這與發(fā)酵后期乙醇含量及總酯含量的變化相對應，而在發(fā)酵后期出現(xiàn)略微上升趨勢這可能與窖內(nèi)菌體自溶，釋放有機酸有關(guān)。

2.3 原酒特征組分分析

取2種窖池各層次糟醅蒸餾二段原酒綜合樣，用氣相色譜測其特征組分如圖15、圖16所示:

由圖可知:兩種封窖方式糟醅原酒乙酸、丁酸、己酸含量相差在0.1～0.2 g/L之間，己酸乙酯含量除中層相差不大外，面糟相差1.0 g/L左右，中下層相差1.8 g/L左右。而總醇(包含甲醇)含量各層次均為新型封窖方式＜傳統(tǒng)封窖方式，說明新型封窖方式能夠有效減少原酒中雜醇油含量，發(fā)酵效果更好。面糟、中下層糟的總酯含量相差在0.1～0.5 g/L之間。這與前文中發(fā)酵后期糟醅乙醇含量及酸度變化相對應。

2.4 出酒率和感官評價分析

對2種封窖方式實驗窖池的出酒率和乳己比進行分析，其中原酒品評結(jié)果為5位省級及以上白酒評委綜合評定，滿分為100分，結(jié)果見表1:

圖15 兩種封窖方式面糟原酒特征組分含量Fig.15 The main characteristics of components of the upper base liquor of two pit sealing mode liquor

圖16 兩種封窖方式中下層糟原酒特征組分Fig.16 The main characteristics of components of the lower base liquor of two pit sealing mode liquor

由表1可知:面糟和中下層糟醅出酒率均為新型封窖方式＞傳統(tǒng)封窖方式，乳己比為新型封窖方式＜傳統(tǒng)封窖方式，原酒品評分數(shù)為新型封窖方式＞傳統(tǒng)封窖方式。這說明，新型封窖方式能夠更好地利用發(fā)酵空間，為發(fā)酵過程中微生物代謝提供更好的環(huán)境，充分利用窖內(nèi)物質(zhì)使發(fā)酵更加徹底，原酒酒質(zhì)更好。

3 結(jié)論與討論

在同一口窖池中，各層次糟醅理化指標存在顯著差異。可能是因為各層次微生物群落最大峰出現(xiàn)時間以及數(shù)目不同。這些差異導致底物利用效率、轉(zhuǎn)化效率、代謝產(chǎn)物積累等情況不同，同時這些差異又反過來影響微生物的生長，最終影響微生物代謝而影響原酒的產(chǎn)量及品質(zhì)。

新型封窖方式與傳統(tǒng)封窖方式相比，為窖內(nèi)微生物生長代謝提供了更好的發(fā)酵空間，使窖內(nèi)物質(zhì)能量傳遞更加充分，各項理化指標更加協(xié)調(diào)，微生物代謝發(fā)酵更加充分、徹底。需要強調(diào)的是傳統(tǒng)封窖方式面糟更多地接觸封窖窖泥容易被雜菌污染，這也是造成面糟酒質(zhì)差的原因。新型封窖方式就避免了這個問題，從而可以更有效地減少原酒中雜醇油含量。

新型封窖方式因為密封效果更好，發(fā)酵過程中窖內(nèi)壓力增大［3］，可以提高窖池內(nèi)黃水線，增大整個窖內(nèi)物質(zhì)循環(huán)效果。使窖內(nèi)物質(zhì)發(fā)酵更加充分，降低原酒乳己比。綜合以上因素，新型封窖方式的出酒率更高。

表1 兩種封窖方式出酒率和感官評價對比Table 1 A comparison of rate and taste evaluation result of the base liquor

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