徐韓飛，范京來，富渭鑫，陳立彰，尤漢杰

（溫州市公安局刑科所，浙江 溫州 325000）

QIAcube小型工作站在生物接觸類檢材提取中的應(yīng)用研究

徐韓飛，范京來，富渭鑫，陳立彰，尤漢杰

（溫州市公安局刑科所，浙江 溫州 325000）

目的 探討QIAcube工作站在生物接觸類檢材中的提取效果。方法 將90份以脫落細(xì)胞粘取膜、實物樣本（紗線轉(zhuǎn)移）或棉簽擦拭物為載體的生物接觸類檢材，分別采用QIAcube工作站、EZ1工作站和手工硅珠法進(jìn)行基因組DNA提取、定量并檢測15個常染色體基因座的STR分型。結(jié)果 利用QIAcube工作站提取的生物接觸類檢材平均檢出率達(dá)到44.4%，其中脫落細(xì)胞粘取膜組檢出率為56.7%，實物紗線轉(zhuǎn)移組檢出率為46.7%，棉簽擦拭物組檢出率為30.0%。脫落細(xì)胞粘取膜組和實物樣本（紗線轉(zhuǎn)移）組均獲得較好的STR分型結(jié)果，所得DNA濃度均優(yōu)于棉簽擦拭物組樣本。QIAcube工作站組平均檢出率為44.4%，手工硅珠法組平均檢出率為43.2%，而EZ1工作站組平均檢出率為26.9%，前兩者平均檢出率明顯高于EZ1工作站組。QIAcube工作站組與硅珠法組所得DNA濃度無顯著差異，但均明顯高于EZ1工作站組。QIAcube工作站組與硅珠法組檢測得到的STR分型RFU值及峰值均衡性均優(yōu)于EZ1工作站組，尤其是大片段基因在前兩組中均能夠被完整檢測到。結(jié)論 采用QIAcube工作站提取生物接觸類檢材檢出率高，STR分型結(jié)果良好，可應(yīng)用于法醫(yī)物證實際案件檢驗。

法醫(yī)遺傳學(xué)；QIAcube；EZ1；硅珠法；生物接觸類檢材

DOΙ: 10.16467/j.1008-3650.2015.02.008

生物接觸類檢材已成為法醫(yī)物證DNA檢驗的常規(guī)檢材，此類檢材存在濃度低、易降解、易污染、含有擴(kuò)增抑制物和二次轉(zhuǎn)移易損耗等問題，檢出率低。本研究擬通過QIAcube小型工作站（以下簡稱QIAcube工作站）對生物接觸類檢材進(jìn)行提取，并與其他方法如EZ1 Advanced小型工作站（以下簡稱EZ1工作站）和手工硅珠法等進(jìn)行比較，探討在檢驗量日趨攀升的背景下如何快速高效地完成生物物證的DNA檢驗。

1 材料與方法

1.1 材 料

隨機(jī)選取2014年4月份本實驗室受理的各類接觸類生物檢材90份，來源均為鼠標(biāo)、門把手和窗戶等汗?jié)撝讣y，室溫保存。脫落細(xì)胞粘取膜、實物樣本紗線轉(zhuǎn)移（利用干濕兩步法將生物樣本DNA轉(zhuǎn)移至紗線）或棉簽擦拭物各30份。

1.2 研究方法

1.2.1 主要儀器與試劑QIAcube工作站、EZ1工作站（QIAGEN公司），Eppendorf熒光定量PCR儀（Eppendorf公司），9700 PCR擴(kuò)增儀、3500XL型遺傳分析儀、GeneMapper?ID-X分 析 軟 件（AB公 司），QIAamp?DNA Investigator Kit試劑盒（以下簡稱QIAamp試劑盒，QIAGEN公司）、EZ1?DNA Investigator Kit試劑盒（以下簡稱EZ1試劑盒， QIAGEN公司），6%硅珠混懸液（Sigma公司），硅珠裂解Lysis Buffer（Promega公司），Identifiler?Plus PCR試劑盒、Quantifiler?DUO定量試劑盒（AB公司）。

1.2.2 方 法DNA提取 90份生物接觸類檢材剪取適量，平均分成三份，以消化裂解液沒過樣本載體為宜。按照QIAcube工作站Forensics Casework Samples：Purification純化程序（以下簡稱Purification程序）在樣本中加入ATL緩沖液300μL（含20μL PK，QIAamp試劑盒自帶），在恒溫混勻儀上1000rpm/min，56℃孵育裂解1h（或2h），將洗脫體積設(shè)置成40μL，自動化提取純化得到DNA樣本；按照EZ1工作站Trace TD純化程序（以下簡稱Trace程序）在樣本中加入G2液200μL（含10μL PK，EZ1試劑盒自帶），在恒溫混勻儀上1000r/min，56℃孵育裂解1h，洗脫體積40μL，自動化提取純化得到DNA樣本；按照參考文獻(xiàn)，采用改良硅珠法［1］，在樣本中加入500μL 左右體積（以沒過載體為宜）的Lysis Buffer（Lysis:1mol/L DTT為100:1），在恒溫混勻儀上1000r/min，95℃孵育裂解0.5h后，吸取上清，加入10μL 6%硅珠混懸液，室溫放置15min，間或混勻，70%冰乙醇洗滌3次，加入40μL TE在56℃恒溫混勻儀上保溫15min，離心轉(zhuǎn)移洗脫得到DNA樣本。

樣本消化時間和擴(kuò)增模板體積的優(yōu)化 隨機(jī)選取20份脫落細(xì)胞粘取膜為載體的生物接觸類檢材，根據(jù)不同的消化時間（1、2h）和模板量（1、2、4μL）將每份樣本分成6組，依照QIAcube工作站Purification純化程序所得DNA含量選擇最佳消化時間和模板擴(kuò)增量。

PCR擴(kuò)增及產(chǎn)物檢測采用Quantifiler?DUO定量試劑盒在Eppendorf熒光定量PCR儀上進(jìn)行提取產(chǎn)物濃度定量。熱循環(huán)參數(shù)參照試劑盒說明書。采用Identifiler?Plus PCR試劑盒在9700 PCR擴(kuò)增儀上進(jìn)行復(fù)合擴(kuò)增。擴(kuò)增體系為10μL，其中反應(yīng)液4μL，引物2μL，模板量4μL（或1、2μL），熱循環(huán)參數(shù)參照試劑盒說明書。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)3500XL型遺傳分析儀檢測，GeneMapper?ID-X軟件分析得到分型結(jié)果。

分型結(jié)果判斷 通過GeneMapper?ID-X軟件分析，獲得9個STR基因座以上（包括9個基因分型），RFU值大于等于50的樣本判定為檢出樣本，9個基因座以下且RFU值小于50的則判定為未檢出樣本［2］。

2 結(jié) 果

2.1 不同消化時間和擴(kuò)增模板量所得DNA濃度比較

隨機(jī)選取的20份脫落細(xì)胞粘取膜為載體的生物接觸類檢材，按照獲得9個STR基因座以上（包括9個基因分型）且RFU值大于等于50的判定標(biāo)準(zhǔn)（含混合分型圖譜），對得到的9份檢出樣本進(jìn)行統(tǒng)計分析。表1顯示，消化時間對DNA濃度的影響差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。樣本模板量為1μL的生物樣本得到的DNA濃度明顯低于模板量為2μL和4μL的生物樣本（P＜0.05）。樣本模板量為2μL和4μL的生物樣本得到的DNA濃度差異雖無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），但從STR分型效果來看，樣本模板量為4μL的檢材對應(yīng)的RFU值及峰值均衡性均優(yōu)于2μL。經(jīng)綜合比較，本研究采用1h消化時間和4μL模板量對樣本進(jìn)行提取和擴(kuò)增。

2.2 不同轉(zhuǎn)移載體QIAcub提取DNA濃度和STR分型

采用QIAcube工作站提取的生物接觸類檢材中，脫落細(xì)胞粘取膜組檢出率達(dá)56.7%，檢出樣本DNA濃度達(dá)（0.263±0.100）ng/μL，實物紗線轉(zhuǎn)移組檢出率達(dá)46.7%，DNA濃度達(dá)（0.195±0.058）ng/μL，棉簽擦拭物組檢出率達(dá)30.0%， DNA濃度達(dá)（0.168±0.084）ng/μL，其平均檢出率達(dá)44.4% （見表2）。結(jié)果顯示，脫落細(xì)胞粘取膜組和實物紗線轉(zhuǎn)移組樣本得到的DNA濃度普遍比棉簽擦拭物組高。兩組檢出樣本均獲得較好的STR分型結(jié)果。

2.3 QIAcube、EZ1與手工硅珠法比較

生物接觸類檢材一式三份，分別采用QIAcube工作站、EZ1工作站和手工硅珠法提取DNA，檢出樣本的DNA平均濃度見表3。QIAcube工作站組平均檢出率為44.4%，手工硅珠法組平均檢出率為43.2%，而EZ1工作站組平均檢出率為26.9%，明顯低于前兩組的檢出率。采用QIAcube工作站處理得到的檢出樣本DNA平均濃度明顯高于EZ1工作站組（P＜0.05），經(jīng)檢測得到的STR分型RFU值及峰值均衡性均優(yōu)于EZ1工作站組，尤其大片段基因能夠被完整檢測到。QIAcube工作站組檢出樣本DNA平均濃度與手工硅珠法組相比，無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）。

在檢材條件較差DNA濃度偏低的樣本中，有8份樣本經(jīng)EZ1工作站取的樣本只有個別基因座檢見，等位基因缺失，RFU值低，且大片段基因座抑制明顯。而同一樣本經(jīng)由QIAcube工作站提取，擴(kuò)增檢測得到的RFU值約能達(dá)到200，獲得9～12個基因座的STR分型。

表1 不同消化時間和不同模板量得到的DNA濃度比較（n=20）Table1 Comparison of DNA yield from different digestion time and template （n=20）

表2 不同載體脫落細(xì)胞的樣本檢出率及DNA 濃度Table2 DNA detection rate and yield from different carriers

表3 三種提取方式處理的樣本檢出率和DNA濃度比較（n=30）Table3 Comparison of detection rate and DNA mass concentration with different extracting system （n=30）

3 討 論

隨著法醫(yī)物證DNA檢驗在刑事案件中普及，勘查人員對生物檢材提取意識和犯罪人員反偵察意識都在提高，煙蒂、現(xiàn)場血、手套甚至貓眼上口香糖等DNA易于檢出的生物物證難以提取得到，門把手、窗戶上的汗?jié)撝讣y等生物接觸類檢材提取與檢驗成為日常檢材，在實際工作中具有重要意義。生物接觸類檢材，絕大部分是汗液斑，其DNA來自脫落的上皮細(xì)胞中部分未角化細(xì)胞的細(xì)胞核［3］。不同個體之間存在汗液分泌多少、基礎(chǔ)代謝率等生理差異，以及接觸的劇烈程度、接觸時間、載體的物理屬性和DNA在載體上的遺留時間等因素可以導(dǎo)致遺留的DNA量差異［4］。這類生物接觸性檢材占實驗室日常檢材的50%以上，但由于其本身DNA濃度低，存在易降解、易污染等問題，往往以未檢見DNA分型譜帶告終。

針對生物接觸類檢材，傳統(tǒng)chelex100法或磁珠法提取為基礎(chǔ)的檢驗方法DNA檢出率往往偏低。而硅珠顆粒細(xì)、混懸液相對穩(wěn)定，可以在高濃度的硫氰酸胍條件下單位體積內(nèi)有更大的表面積與DNA分子結(jié)合，檢驗效率較chelex100和磁珠等顆粒介質(zhì)高［5］。但硅珠顆粒在TE、水等胍鹽以外的離子緩沖條件下，即使高速離心，硅珠顆粒仍容易飄浮，若進(jìn)入擴(kuò)增系統(tǒng)會降低DNA擴(kuò)增效率。另外，硅珠顆粒不溶于胍鹽緩沖液，離心后不易形成混懸液，提取過程消耗體力，在日常檢案中無法規(guī)模化，僅限于小范圍使用。以上特性使得傳統(tǒng)硅珠法與工作站很難有機(jī)相結(jié)合，不易形成自動化或半自動化。QIAcube 工作站最大的優(yōu)勢是，其QIAamp MinElute?柱以硅膠膜為基礎(chǔ)，利用QIAamp試劑實現(xiàn)半自動化。在變性條件下用蛋白酶K裂解細(xì)胞并將DNA釋放，使DNA在硫氰酸胍緩沖液中結(jié)合到MinElute柱硅膠膜上，用洗滌液洗去殘留雜質(zhì)，最后將DNA從MinElute柱硅膠膜上洗脫得到高純度、濃縮的DNA。提取階段徹底擺脫硅珠顆粒，DNA擴(kuò)增可以實現(xiàn)機(jī)械化加樣，減少人為操作失誤，提高實驗室信息化。

本研究利用QIAcube工作站及QIAamp MinElute?柱和QIAamp?試劑盒相結(jié)合實現(xiàn)了生物接觸類檢材高效、快捷的自動化DNA提取。平均檢出率達(dá)到44.4%，其中QIAcube工作站提取的脫落細(xì)胞粘取膜檢出率達(dá)到56.7%，與文獻(xiàn)報道的微量檢材提取成功率相近［2，6］。QIAcube系統(tǒng)具有以下幾個優(yōu)勢：（1）取材量少，本研究中，每個檢材均一式三份，如脫落細(xì)胞粘取膜為載體的樣本，只剪取1/3量的膜表面，有效解決傳統(tǒng)生物接觸類檢材由于DNA含量低導(dǎo)致樣本無法復(fù)核的窘境；（2）DNA質(zhì)量高，MinElute?柱以硅膠膜為基礎(chǔ)，在單位體積有相對較大的表面積與DNA分子結(jié)合，效率高，得到高純度DNA；（3）提取效率高，對樣本進(jìn)行56℃孵育裂解1h后，在75 min內(nèi)自動化完成一輪提取實驗，一次性提取樣本最多可以達(dá)到12個；（4）洗脫體積在20～100μL之間，選擇范圍大，對于DNA含量甚微的生物接觸類檢材可以采用20μL洗脫微體積，提高相對檢測濃度；（5）實現(xiàn)自動化，微量檢材與常規(guī)生物檢材可在同一平臺進(jìn)行DNA提?。唬?）全封閉式提取倉，避免微量檢材相互之間交叉污染；（7）與EZ1工作站相比，通量增加一倍，耗材成本相對低廉。而QIAcube工作站的缺點則有以下兩點：（1）上機(jī)前需要孵育、擺管、轉(zhuǎn)管和配制緩沖液等，相當(dāng)耗力；（2）去掉上機(jī)前準(zhǔn)備工作，整個程序運行時間為75min，與EZ1工作站的17min相比，時間上無優(yōu)勢。

［1］ 楊電，劉超，徐曲毅，等.人體接觸檢材前處理方式對磁珠法提取DNA 效果的影響［J］.法醫(yī)學(xué)雜志，2011，26（5）: 393-396.

［2］ 楊電，劉超，徐曲毅，等.微量口腔脫落細(xì)胞檢材的DNA檢驗［J］.法醫(yī)學(xué)雜志，2008， 24（2）: 126-128.

［3］ Fregeau C J， Germain O， Founrey R M.Fingerprint enhancement revisited and the effects of blood enhancement chemicals on subsequent profiler plus fluorescent short tandem repeat DNA analysis of flesh and aged bloody fingerprints ［J］.J Forensic Sci， 2000， 45（2）: 345-380.

［4］ 張廣峰，陳松，涂政，等.接觸DNA檢驗成功的影響因素探討［J］.刑事技術(shù)，2013（3）: 9-13.

［5］ 鄭秀芬.法醫(yī)DNA分析［M］.北京：中國人民公安大學(xué)出版社，2002: 37-59.

［6］ 楊凡，梅善宗，李永宏，等.簽字筆上附著的脫落上皮細(xì)胞STR分型［J］.法醫(yī)學(xué)雜志，2008， 24（1）: 34-36.

引用本文格式：徐韓飛，范京來，富渭鑫，等.QIAcube小型工作站在生物接觸類檢材提取中的應(yīng)用研究［J］.刑事技術(shù)，2015，40（2）：118-121.

QIAcube System in Touch DNA Extraction

XU Han-fei， FAN Jing-lai， FU Wei-xin， CHEN Li-zhang， YOU Han-jie
（Ιnstitute of Forensic Science， Wenzhou Public Security Bureau， Zhejiang Wenzhou 325000， China）

Objective To explore the applicability of QΙAcube Forensics Casework DNA extraction system into extracting touch DNA and evaluate the effect.Methods 30 samples were transferred from forensic biological evidence using tape-lifting technique， 30 samples transferred by yarns and 30 samples transferred using double swab technique.All these 90 samples were extracted by QΙAcube， EZ1 and SiO2extraction systems respectively， then quantifi ed and detected by STR typing.Results Up to 44.4% touch DNA were successfully detected by QΙAcube extraction system， with successful rate of 56.7% in tape-lifting group， 46.7% in yarns group and 30.0% in double swab group.Both forensic biological evidence of tape lifting group and yarns group got good STR typing results using QΙAcube extraction system，and the DNA concentrations were higher than that of swab group.QΙAcube and SiO2extraction system got good STR typing， especially at the large fragment loci，and the concentrations of extracted DNA were higher than that of EZ1 extraction system.Up to 44.4% touch DNA were detected by QΙAcube extraction system， while the SiO2extraction system was 43.2% and the EZ1 extraction system was 26.9%.There was no statistical difference in DNA concentration between QΙAcube and SiO2system， which were both obviously higher than that of EZ1 extraction system.Conclusions QΙAcube extraction system is an effective method to extract DNA from forensic biological evidence， applicable into forensic practice.

forensic genetics； QΙAcube； EZ1； silicon bead-based methal； touch DNA sample

DF795.2

A

1008-3650（2015）02-0118-04

徐韓飛（1983—），女，浙江瑞安人，法醫(yī)師，碩士，研究方向為法醫(yī)物證學(xué)。 E-mail：xuhanfei0219023@163.com

2014-06-16