白志瑤　孫繼芹　尹春瓊　王星花　包銳

EDTA-K2、枸櫞酸鈉抗凝劑依賴性假性血小板減少2例分析

白志瑤孫繼芹尹春瓊王星花包銳

作者單位:655000曲靖市，云南省曲靖市第二人民醫(yī)院檢驗科

目的探討2例EDTA（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）-K2、枸櫞酸鈉抗凝劑依賴性假性血小板（platelet，PLT）減少患者PLT計數(shù)的檢測方法。方法采用SYSMEX-4000i血細胞分析儀檢測EDTA-K2和枸櫞酸鈉（1∶9）抗凝的PLT計數(shù)，采用手工稀釋計數(shù)法作為參考方法。分別于采血后1 min、10 min、20 min、30 min、40 min、60 min和120 min檢測PLT計數(shù)，并對兩種抗凝劑血標本進行涂片瑞氏染色，在顯微鏡下觀察PLT聚集情況。結(jié)果EDTA-K2抗凝的PLT在10 min時開始出現(xiàn)聚集現(xiàn)象，枸櫞酸鈉（1∶9）抗凝的PLT在20 min出現(xiàn)聚集現(xiàn)象，兩種抗凝劑的PLT均在120 min達到聚集高峰。而EDTA-K2抗凝的PLT在各時間段的聚集情況均較枸櫞酸鈉（1∶9）抗凝的PLT明顯。PLT計數(shù)結(jié)果顯示，隨著時間的延長，兩種抗凝劑抗凝的PLT計數(shù)結(jié)果均呈下降趨勢，其中EDTA-K2抗凝的PLT計數(shù)僅在1 min時在正常范圍，枸櫞酸鈉（1∶9）抗凝的PLT計數(shù)在1 min和10 min時均在正常范圍。枸櫞酸鈉（1∶9）抗凝的PLT計數(shù)在各時間段均高于EDTA-K2抗凝的PLT計數(shù)，但仍低于手工稀釋計數(shù)法。結(jié)論PLT計數(shù)應(yīng)盡量縮短檢測時間，以避免時間對檢測結(jié)果的影響，并注意EDTA-K2依賴性假性PLT減少的檢出。對于EDTA-K2、枸櫞酸鈉兩種抗凝劑均存在依賴性假性PLT減少的血標本，應(yīng)采用手工稀釋計數(shù)法進行檢測，以避免因PLT假性減少引起的誤診、誤治，為臨床提供準確、可靠的治療依據(jù)。

EDTA-K2；枸櫞酸鈉；假性血小板減少；血小板計數(shù)

乙二胺四乙酸 （ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）鹽具有對紅細胞、白細胞形態(tài)影響很小且能阻止血液凝固的優(yōu)點，因此國際血液學(xué)標準化委員會于1993年推薦將EDTA-K2作為血細胞計數(shù)的抗凝劑，目前在世界各地得到廣泛應(yīng)用［1］。但在實際工作中，EDTA-K2抗凝劑可引起極少數(shù)人的血小板（platelet，PLT）發(fā)生聚集，導(dǎo)致血細胞分析儀PLT計數(shù)假性減少和白細胞假性升高的現(xiàn)象，即為EDTA依賴性假性血小板減少癥 （EDTA-pseudo thrombocytopenic purpura，EDTA-PTCP），國外臨床發(fā)生率為0.07%～1.0%，而國內(nèi)報道為0.77%，國外有報道EDTA-PTCP用枸櫞酸鈉抗凝后，有72%的病例還是有聚集，但國內(nèi)對此報道甚少［2］。我院自2014年1月-2015年9月共發(fā)現(xiàn)因EDTA-K2造成血小板假性減少患者7例，其中5例更換抗凝劑為枸櫞酸鈉（1∶9）后PLT計數(shù)正常，血涂片瑞氏染色顯微鏡檢查顯示PLT分布正常；2例EDTA-K2、枸櫞酸鈉（1∶9）兩種抗凝劑均導(dǎo)致依賴性假性血小板減少，血細胞分析儀PLT計數(shù)結(jié)果異常，現(xiàn)報告如下。

1　資料與方法

1.1臨床資料病例1，女性，32歲，因“反復(fù)性下腹疼痛1年半”于2015年2月1日入住我院婦科。入院初診:1.慢性盆腔炎；2.右側(cè)輸卵管黏連并積水；3.鞍形子宮；4.查體:體溫: 36.5℃、脈搏:68次/min、呼吸:18次/min、血壓:102/69 mmHg，皮膚、鞏膜無黃染、無瘀點、瘀斑；5.實驗室檢查:肝腎功能、電解質(zhì)正常，傳染病免疫標志物檢測:陰性；凝血酶原時間:10.3 s、國際標準化比值:0.90、活化部分凝血酶原時間: 36.3 s、凝血酶時間:19.7 s、纖維蛋白原:2.01 g/L。2015年2月2日SYSMEX-4000i血細胞分析儀術(shù)前血常規(guī)結(jié)果:白細胞計數(shù):8.02×109/L、紅細胞計數(shù):4.35×1012/L、血紅蛋白:133 g/L、血細胞比容:37.1%、PLT:4×109/L、平均紅細胞容積:85.3 fl、平均紅細胞血紅蛋白含量:30.6 pg、平均紅細胞血紅蛋白濃度:358 g/L、紅細胞分布寬度 （red blood cell distribution width，RDW）-SD:33.1 fl、RDW-CV:11.0%。該患者于2015年2月4日行“腹腔鏡盆腔黏連分離術(shù)+宮腔鏡檢查+美蘭通液術(shù)”，手術(shù)順利，術(shù)中出血約10 ml，屬Ⅱ類切口，術(shù)后給予促宮縮、抗炎、對癥治療，病情恢復(fù)平穩(wěn)，于2015年2月10日出院。遵醫(yī)囑，分別于3個月、6個月回訪無特殊不適。

病例2，男性，86歲，因“咳嗽、咳痰、喘息、發(fā)熱 1 d”，于2015年7月25日入住我院呼吸內(nèi)科。入院初診:1.查體:體溫:38.5℃、脈搏:90次/min、呼吸:18次/min、血壓:112/66 mmHg，一般情況欠佳，神清，唇舌發(fā)紺、咽部充血，肺氣腫征象，雙肺呼吸音低、雙肺可聞及濕性啰音、散在哮鳴音，心律齊、未聞及雜音，腹軟、劍突下壓痛、無反跳痛，雙下肢輕度水腫，皮膚、鞏膜無黃染、無瘀點、瘀斑。2.實驗室檢查:總蛋白: 76.5 g/L、白蛋白:26.9 g/L、球蛋白:49.6 g/L、白蛋白/球蛋白:0.54、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶:103 U/L、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶:25 U/L、谷氨酰轉(zhuǎn)移酶:46 U/L、膽堿酯酶:2025 U/L、低密度脂蛋白:249 U/L、高密度脂蛋白:263 U/L、葡萄糖:7.08 mmol/L；傳染病免疫標志物檢測:陰性；凝血酶原時間:14.7 s、國際標準化比值:1.08、活化部分凝血酶原時間:41.9 s、凝血酶時間:20.3 s、纖維蛋白原:2.12 g/L。2015年7月27日SYSMEX-4000i血細胞分析儀血常規(guī)結(jié)果:白細胞計數(shù): 4.59×109/L、紅細胞計數(shù):3.66×1012/L、血紅蛋白:109 g/L、血細胞比容:35.8%、PLT:11×109/L、平均紅細胞容積:97.8 fl、平均紅細胞血紅蛋白含量:29.8 pg、平均紅細胞血紅蛋白濃度: 304 g/L、RDW-SD:60.8 fl、RDW-CV:18.1%。

1.2方法

1.2.1血細胞分析儀檢測血常規(guī)標本分別采用EDTA-K2和枸櫞酸鈉（1∶9）抗凝，PLT計數(shù)采用SYSMEX-4000i血細胞分析儀檢測。

1.2.2手工稀釋法采用草酸鹽溶液稀釋血常規(guī)標本，血涂片經(jīng)瑞氏染色后在顯微鏡下計數(shù)PLT。以手工稀釋法為參考方法［3］評價血細胞分析儀對兩種抗凝劑抗凝的血標本PLT計數(shù)情況。

1.2.3PLT各時間段聚集情況觀察分別將EDTA-K2和枸櫞酸鈉（1∶9）抗凝的血標本在采集后1 min、10 min、20 min、30 min、40 min、60 min、120 min時進行涂片，經(jīng)瑞氏染色后顯微鏡下觀察PLT聚集情況。

2　結(jié)果

2.1EDTA-K2、枸櫞酸鈉（1∶9）抗凝的PLT聚集情況2例患者的EDTA-K2抗凝血標本在肉眼觀察下無凝塊，儀器檢測時報警PLT聚集，PLT直方圖出現(xiàn)翹尾、無擬合曲線，用抗凝血涂片瑞氏染色顯微鏡檢查，可見PLT聚集，聚集的血小板數(shù)量不等、多少不一，呈小簇、成堆或片狀分布，因而懷疑是EDTA-PTCP，當日即告知臨床請患者到我科再次采集血標本，并分別采用EDTA-K2、枸櫞酸鈉（1∶9）2種抗凝劑抗凝，分別于1 min、10 min、20 min、30 min、40 min、60 min、120 min進行PLT計數(shù)，并用抗凝血涂片瑞氏染色在顯微鏡下觀察，PLT在不同時間段呈不同程度聚集，在120 min時達到聚集高峰，可見小簇、成堆、片狀聚集，見圖1、圖2（2例患者兩種抗凝劑抗凝的血涂片各時間段PLT聚集情況相似）。

2.2血細胞分析儀檢測兩種抗凝劑PLT計數(shù)及手工稀釋法PLT計數(shù)結(jié)果2例患者的手工PLT計數(shù)結(jié)果在各時間段變化不大，且均在正常范圍。而分別采用EDTA-K2和枸櫞酸鈉（1∶9）抗凝的PLT計數(shù)結(jié)果隨著時間的延長均呈下降趨勢，其中枸櫞酸鈉（1∶9）抗凝的PLT計數(shù)結(jié)果在1 min和10 min時在正常范圍，EDTA-K2抗凝的PLT計數(shù)結(jié)果僅于1 min時在正常范圍。雖然枸櫞酸鈉（1∶9）抗凝的PLT計數(shù)結(jié)果在各時間段均高于EDTA-K2抗凝的PLT計數(shù)結(jié)果，但仍低于手工計數(shù)，見圖3、圖4。

圖1　患者EDTA-K2抗凝血涂片各時間段PLT聚集情況（瑞氏染色，×1000）

3　討論

PLT是由骨髓中成熟巨核細胞的胞質(zhì)脫落而成，PLT的生理功能包括黏附、聚集、釋放等，主要功能是凝血、止血作用和修補破損的血管，這些功能是在PLT激活后幾乎同時出現(xiàn)的。當PLT計數(shù)降低時，很容易發(fā)生出血不止的現(xiàn)象，給患者的生命帶來威脅。然而，臨床有少數(shù)患者存在EDTAPTCP，導(dǎo)致檢驗結(jié)果不準確，無法指導(dǎo)臨床治療。

圖2　患者枸櫞酸鈉（1∶9）抗凝血涂片各時間段PLT聚集情況（瑞氏染色，×1000）

EDTA-PTCP產(chǎn)生的原因與PLT表面存在的某種隱匿性抗原有關(guān)［4］。EDTA可誘導(dǎo)PLT活化，導(dǎo)致PLT糖膜改變［5］，即PLT形態(tài)發(fā)生變化，由正常的圓盤狀變?yōu)閳A球形，導(dǎo)致PLT膜表面某種隱匿性抗原構(gòu)象的改變，這些活化的PLT與血漿中存在的自身抗體抗PLT抗體和（或）抗心磷脂抗體結(jié)合，激活細胞膜中的某些活性物質(zhì)，這些活性物質(zhì)能活化PLT纖維蛋白受體，促使PLT與FIB聚集成團［6］。血細胞分析儀錯將聚集的PLT誤認為WBC或巨大PLT從而導(dǎo)致PLT計數(shù)假性降低。而PLT計數(shù)假性降低若未及時發(fā)現(xiàn)，易導(dǎo)致臨床發(fā)生誤診誤治。而臨床醫(yī)生為了明確診斷，往往會進行骨髓穿刺涂片檢查，個別病例甚至已經(jīng)開始藥物治療，這樣既增加了患者的痛苦和精神負擔，同時也增加了醫(yī)療費用。

圖3　病例1患者EDTA-K2、枸櫞酸鈉、手工PLT計數(shù)結(jié)果

圖4　病例2患者EDTA-K2、枸櫞酸鈉、手工PLT計數(shù)結(jié)果

檢驗科在遇到PLT計數(shù)假性降低時，會選擇更換抗凝劑［一般選擇枸櫞酸鈉（1∶9）］后重新采血檢測，以避免EDTAPTCP。枸櫞酸鈉是一種鈣的螯合劑，呈堿性，可與鈣離子形成可溶性螯合物，其抗凝性弱，易使PLT聚集而致其計數(shù)假性減少，并且枸櫞酸鹽抗凝能力不強，不僅對PLT計數(shù)有影響，對WBC計數(shù)和分類均有不同程度影響［7］。大部分EDTA-K2引起的假性PLT減少可以被枸櫞酸鈉糾正，但也有極少部分無法糾正［8］。

本文研究的2例患者，在采血后1 min、10 min、20 min、30 min、40 min、60 min和120 min時分別采用血細胞分析儀檢測兩種抗凝劑抗凝的PLT計數(shù)及手工稀釋法PLT計數(shù)，并將抗凝血瑞氏染色涂片在鏡下觀察PLT聚集情況，結(jié)果顯示，EDTA-K2抗凝的PLT在各時段均有不同程度的聚集，且在120 min達到聚集高峰，可見片狀聚集。而枸櫞酸鈉（1∶9）抗凝的PLT在1 min時尚未出現(xiàn)聚集現(xiàn)象，在10 min時出現(xiàn)少量聚集，在120 min時達到聚集高峰，但其各時間段的聚集程度均沒有EDTA-K2抗凝的PLT聚集明顯，這與鄺妙歡等［9］的報道一致。2例患者的血標本對EDTA-K2和枸櫞酸鈉（1∶9）抗凝劑均存在PLT計數(shù)假性減少，而且隨著時間的延長PLT計數(shù)值也隨之下降，枸櫞酸鈉（1∶9）抗凝的PLT計數(shù)結(jié)果在各時間段均高于EDTA-K2抗凝的PLT計數(shù)，但仍低于手工稀釋法PLT計數(shù)。其中EDTA-K2抗凝的PLT計數(shù)僅在1 min時在正常范圍，而枸櫞酸鈉 （1∶9）抗凝的PLT計數(shù)在1 min和10 min時均在正常范圍，說明EDTA-K2較枸櫞酸鈉（1∶9）更易造成PLT假性減少，而且時間是導(dǎo)致抗凝劑依賴性假性PLT減少的原因之一。因此若進行血常規(guī)檢測時出現(xiàn)PLT顯著減少、直方圖異常、儀器報警PLT聚集等，且患者無瘀點、瘀斑等出血情況，應(yīng)高度懷疑EDTA-PTCP。采用血涂片鏡檢觀察PLT的數(shù)量、形態(tài)，尤其要注意片尾、邊緣是否有PLT聚集。同時請患者到檢驗科進行采血，以縮短標本檢測時間，并更換抗凝劑重新檢測，若仍無法糾正結(jié)果，應(yīng)采用手工稀釋計數(shù)法進行PLT計數(shù)，以保證檢驗結(jié)果的準確性。

總之，對于抗凝劑依賴性假性PLT減少，臨床較常見的為EDTA-PTCP，對兩種抗凝劑均存在依賴性假性PLT減少的病例非常罕見，在實際工作中若遇到此種情況，應(yīng)采用手工稀釋法計數(shù)進行復(fù)核，以避免因PLT假性減少引起的誤診、誤治，為臨床提供準確、可靠的治療依據(jù)。

1Cohen AM，Cycowitz Z，Mittelman M，et al.The incidence of pseudothrombocytopenia in automatic blood analyzers.Haematologia（Budap），2000，30:117-121.

2丁邦顯，劉思景.抗凝劑EDTA-K2引起的血小板減少原因分析.檢驗醫(yī)學(xué)與臨床，2011，8:2357-2358，2360.

3劉學(xué)斌，鄒雪梅，黃冬梅，等.兩種抗凝劑對血小板的影響因素臨床分析.河北醫(yī)學(xué)，2013，19:1595-1597.

4Bragagni G，Bianconcini G，Brogna R，et al.Pseudothrombocytopenia:clinical comment on 37 cases.Minerva Med，2001，92:13-17.

5Rao GH，Peller JD，White JG.Influence of ionized calcium on thrombin-induced down regulation of GPIb/IX receptors on human platelets.Thromb Res，1997，85:23-31.

6Bizzaro N，Brandalise M.EDTA-dependent pseudothrombocytopenia. Association with antiplatelet and antiphospholipid antibodies.AM J Clin pathol，1995，103:103-107.

7王偉，王海梅，楊萍，等.EDTA-K2和枸櫞酸鈉同時依賴的假性血小板減少病例分析.中華全科醫(yī)學(xué)雜志，2013，11:786-787.

8徐秀湖，朱潔琳.EDTA-K2和枸櫞酸鈉1∶4抗凝劑均引起血小板假性減少1例報道.實驗與檢驗醫(yī)學(xué)，2014，32:362-364.

9鄺妙歡，劉曉華，鐘義富，等.EDTA依賴性假性血小板減少癥血小板的檢測.國際檢驗醫(yī)學(xué)雜志，2010，31:1224-1225，1228.

（本文編輯:張志成）

10.3969/j.issn.1674-7151.2015.04.017

（2015-10-13）