孫　穎，田云霄，王雙海，楊新順，趙向榮，辛禮輝，牛廣旭，郭小娟

(1.邯鄲市中心醫(yī)院 病理科，河北 邯鄲 056003； 2.邯鄲肥鄉(xiāng)縣醫(yī)院 麻醉科，河北 邯鄲 057550； 3.邯鄲市中心醫(yī)院 放療科，河北 邯鄲 056003)

甲狀腺乳頭狀癌中C-met mRNA和C-src mRNA的表達及其相關(guān)性研究

孫穎1，田云霄1，王雙海2，楊新順3，趙向榮1，辛禮輝1，牛廣旭1，郭小娟1

(1.邯鄲市中心醫(yī)院 病理科，河北 邯鄲 056003； 2.邯鄲肥鄉(xiāng)縣醫(yī)院 麻醉科，河北 邯鄲 057550； 3.邯鄲市中心醫(yī)院 放療科，河北 邯鄲 056003)

目的檢測C-met mRNA和C-src mRNA在甲狀腺乳頭狀癌(thyroid papillary cancer，TPC)中的表達并探討其與臨床病理特征的關(guān)系。方法采用半定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)方法檢測46例甲狀腺乳頭狀癌和18例良性病變中C-met mRNA和C-src mRNA的表達，并分析二者表達的相關(guān)性及其與臨床病理特征的關(guān)系。結(jié)果C-met mRNA和C-src mRNA在TPC中的表達量分別為1.140±0.163和0.984±0.187，在甲狀腺良性病變的表達量分別為0.467±0.237和0.484±0.254，二者在TPC與甲狀腺良性病變的表達差異均有顯著性意義(P<0.001，P<0.001)。TPC組織C-met mRNA的表達量與患者年齡有關(guān)(P<0.05)；TPC組織C-src mRNA的表達量與腫瘤大小及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(均P<0.05)。 TPC中C-src mRNA和C-met mRNA的表達量呈正相關(guān)(r=0.764，P<0.001)。結(jié)論TPC存在C-src mRNA和C-met mRNA的異常表達且C-src mRNA可能能為TPC的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移提供依據(jù)。

甲狀腺腫瘤；乳頭狀癌；C-src mRNA；C-met mRNA；逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)

[引用本文]孫穎，田云霄，王雙海，等. 甲狀腺乳頭狀癌中C-met mRNA和C-src mRNA的表達及其相關(guān)性研究[J].大連醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2015,37(3)：223-226.

甲狀腺乳頭狀癌(thyroid papillary cancer，TPC)是甲狀腺癌最常見的類型，約占甲狀腺癌的70%～80%，影響甲狀腺乳頭狀癌的治療和預(yù)后因素較多，局部侵襲和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是其中的主要因素。細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)在腫瘤的侵襲與轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮著重要的作用。目前，國內(nèi)對C-src和C-met作為細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中的重要因素與甲狀腺乳頭狀癌的關(guān)系研究較少。本研究通過逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(reverse transcriptase-polymerase chain reaction，RT-PCR)檢測C-met mRNA和C-src mRNA在TPC中的表達，探討二者表達的相關(guān)性及其與臨床病理特征的關(guān)系。以期為制定甲狀腺乳頭狀癌的個體化治療方案及預(yù)后的評估提供新的理論依據(jù)。

1　材料和方法

1.1臨床資料

檢測組織取自2012年2月—2013年12月于邯鄲市中心醫(yī)院行甲狀腺全切或次全切的甲狀腺乳頭狀癌的初治患者標(biāo)本46例和甲狀腺良性病變18例(包括結(jié)節(jié)性甲狀腺腫15例、甲狀腺腺瘤3例)。46例甲狀腺乳頭狀癌標(biāo)本中，男18例，女28例，年齡18～75歲，中位年齡45歲，平均年齡為41.17歲。TNM分期Ⅰ期25例，Ⅱ期4例，Ⅲ期15例，Ⅳ期2例。按照甲狀腺微小乳頭狀癌的診斷標(biāo)準(zhǔn)：16例腫瘤的最大直徑≤1 cm，30例腫瘤最小直徑>1 cm，35例伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。標(biāo)本常規(guī)取材，分為兩份，一份立即放入液氮中凍存，隨后轉(zhuǎn)入-80 ℃冰箱儲存，另一部分置于10%福爾馬林溶液中固定，常規(guī)石蠟包埋、切片。這些病例均經(jīng)本院兩位高年資病理科醫(yī)生按世界衛(wèi)生組織分類標(biāo)準(zhǔn)進行形態(tài)學(xué)觀察，并獨立作出診斷。

1.2RT-PCR法檢測C-met mRNA和C-src mRNA表達

(1)標(biāo)本總RNA提?。簭?80 ℃冰箱取出標(biāo)本，每份標(biāo)本取50 mg組織勻漿后，采用TRIzol(美國Beyozol公司)一步法提取組織中的總RNA，并采用紫外分光光度計測量其純度，選用1.8≤A260/A280≤2.0的RNA進行逆轉(zhuǎn)錄。(2)PCR擴增：C-metmRNA擴增片段長度101 bp，上游引物為Forward Primer：5’.GCTGGAACACCCAGATTGTTTC.3’；下游引物為Reverse Primer：5’.CGACAACTAGAGCCATGTTGATG.3’。C-src mRNA擴增片段長度為250 bp，上游引物為5’.CATCCAAGCCTCAGACCCA.3’；下游引物為5’.TGACACCACGGCATACAGC.3’。內(nèi)參引物β-actin擴增片段長度為480 bp，上游引物為5’.GGCATGGGTCAGAAGGATTCC.3’；下游引物為5’.ATGTCACGCACGATTTCCCGC.3’。 C-met mRNA、C-src mRNA和β-actin引物均由大連寶生物工程公司合成。C-met和β-actin同管進行反應(yīng)，C-met基因擴增：95 ℃變性5 min后，進行94 ℃ 50 s、52 ℃ 1 min、72 ℃ 1 min，重復(fù)39個循環(huán)；C-src和β-actin同管進行反應(yīng)，C-src mRNA基因擴增：95 ℃變性5 min后，進行94 ℃ 50 s、52 ℃ 1 min、72 ℃ 1 min，重復(fù)36個循環(huán)。(3)半定量PCR結(jié)果判斷：內(nèi)參照β-actin基因片段長度為480 bp。目的基因C-met片段和C-src片段長度分別為101 bp 和250 bp 。PCR產(chǎn)物在1.5%瓊脂糖凝膠中電泳，采用凝膠成像系統(tǒng)讀取電泳條帶的斑點光密度掃描值，將目標(biāo)條帶與β-actin條帶的比值作為目標(biāo)基因mRNA的相對表達量。

1.3統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS16.0統(tǒng)計軟件：C-met mRNA和C-src mRNA在TPC和良性病變中的表達及其與臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系采用t檢驗；C-met mRNA和C-src mRNA在TPC中表達的相關(guān)性采用Spearman秩相關(guān)分析。RT-PCR結(jié)果表達量以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)　果

2.1C-met mRNA的表達量及其與臨床病理特征的關(guān)系

C-met mRNA在TPC中的表達量(1.140±0.163)高于甲狀腺良性病變組織(0.467±0.237)，差異有顯著性意義(P<0.001)。C-met mRNA在TPC和甲狀腺良性病變組織中表達陽性率分別為93.5%和16.7%。年齡>45歲組的表達量(1.197±0.868)高于年齡≤45歲組(1.063±0.198)，差異有顯著性意義(P<0.05)。C-met mRNA在TPC中的表達與腫瘤大小、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及患者性別無相關(guān)性(P>0.05)。見圖1，表1。

圖1　C-met mRNA在TPC中的表達Fig 1 Expressions of C-met mRNA in TPCM：Marker；1～6：年齡≥45歲的TPC病例；7～10：年齡<45歲的TPC病例；11～12：良性病例

2.2C-src mRNA的表達量及其與臨床病理特征的關(guān)系

C-src mRNA在TPC中的表達量(0.984±0.187)高于甲狀腺良性病變組織(0.484±0.254)，差異有顯著性意義(P<0.001)。C-src mRNA在TPC和甲狀腺良性病變組織中表達陽性率分別為78.3%和27.8%。腫瘤>1 cm組的表達量(1.031±0.151)高于腫瘤≤1 cm組(0.880±0.249)，差異有顯著性意義(P<0.05)；伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組的表達量(1.017±0.154)高于腫瘤無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組(0.896±0.220)，差異有顯著性意義(P<0.05)。C-src mRNA在TPC中的表達量與患者年齡、性別無相關(guān)性(P>0.05)。見表1，圖2。

2.3C-met mRNA和C-src mRNA在TPC中表達的相關(guān)性

圖2　C-src mRNA在TPC中的表達Fig 2 Expressions of C-src mRNA in TPC

M：Marker；1～3：腫瘤直徑>1 cm病例；4～5：伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移病例；6～10：腫瘤直徑≤1 cm病例；11～12：良性病例

經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析，Spearman秩相關(guān)結(jié)果顯示，C-met mRNA和C-src mRNA在TPC中表達之間呈正相關(guān)(r=0.764，P<0.001)。

表1　TPC中C-met mRNA和C-src mRNA表達量與臨床病理特征之間的關(guān)系Tab 1 Relationship between expression level of C-met mRNA and C-src mRNA and clinicopathological features

3　討　論

C-met是由C-met原癌基因編碼的具有酪氨酸激酶活性的跨膜受體，C-met基因位于第7 號染色體7q21-q31，DNA長度約為120 kbp，包含21個外顯子和20個內(nèi)含子。成熟C-met蛋白的α鏈位于細(xì)胞膜外，與β鏈中暴露于細(xì)胞表面的N端部分共同參與和配體肝細(xì)胞生長因子(hepatocyte growth factor，HGF)的結(jié)合；β鏈橫跨細(xì)胞膜，跨膜區(qū)由高度疏水性氨基酸殘基組成，是細(xì)胞外信號進行跨膜轉(zhuǎn)導(dǎo)的重要部位[1]。C-met廣泛表達于人體正常組織，但在多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展或轉(zhuǎn)移過程中有過表達和基因擴增現(xiàn)象。因為基因擴增、轉(zhuǎn)錄上調(diào)、點突變或其配體自分泌循環(huán)的建立，使得在多種不同組織類型的腫瘤細(xì)胞中可觀察到C-met激酶的異常激活。肝細(xì)胞生長因子(hepatocyte growth factor，HGF)是C-met的唯一配體，通過HGF和C-met結(jié)合使受體自身磷酸化，增強了酪氨酸激酶的活性，接著通過復(fù)雜的機制引發(fā)包括C-src等多個蛋白的酪氨酸磷酸化，最終調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化、侵襲和轉(zhuǎn)移等[2-5]。

本研究應(yīng)用RT-PCR方法，檢測48例TPC中C-met的相對表達量明顯高于甲狀腺良性病變組，與Ruggeri RM等[6]采用免疫組化方法的實驗結(jié)果相似。Müller S等[7]采用RT-PCR方法，發(fā)現(xiàn)C-met mRNA能促進腎細(xì)胞癌血管發(fā)生、轉(zhuǎn)移及運動等，提示C-met基因的擴增在TPC發(fā)生、發(fā)展中起重要作用。同時本研究發(fā)現(xiàn)年齡≥45歲與年齡<45歲的患者C-met mRNA表達量差異有顯著性意義(P=0.040)，說明C-met mRNA在TPC中的表達隨年齡增長，表達增強，這與Bedewy M等[3]通過免疫組化的方法在經(jīng)典霍奇金淋巴瘤研究中得到的結(jié)論較一致。臨床上，甲狀腺乳頭狀癌好發(fā)于青壯年，45歲及以上老年甲狀腺乳頭狀癌發(fā)病率相對較低，關(guān)于甲狀腺乳頭狀癌與年齡的相關(guān)性研究鮮見報道。有研究顯示，在胃癌中，C-met mRNA的表達與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移存在相關(guān)性[8]，但本實驗中C-met mRNA的表達與甲狀腺乳頭狀癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及腫瘤的大小無相關(guān)性。

C-src是一個相對分子量為60 kDa、416位點磷酸化后激活的Src蛋白， C-src表達產(chǎn)物為pp60c-src，是魯斯氏肉瘤病毒癌基因的同源基因，是一種非受體酪氨酸激酶， Src家族產(chǎn)物磷酸化有調(diào)控E-cad與細(xì)胞骨架復(fù)合體的功能，降低細(xì)胞間的黏附，從而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的侵襲與轉(zhuǎn)移，因此C-src基因在細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖分化及腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移中起重要作用。

Bertotti A等[9]研究顯示Src抑制劑能有效地抑制Src信號傳導(dǎo)通路，從而抑制甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞的生長。本研究發(fā)現(xiàn)C-src mRNA在TPC中的表達量與在甲狀腺良性病變中的表達量存在明顯差異，因此認(rèn)為C-src mRNA在TPC的發(fā)生、發(fā)展中起到了重要作用。對實驗數(shù)據(jù)的進一步分析顯示C-src mRNA在TPC中的表達量與腫瘤大小有關(guān)， C-src mRNA在腫瘤≤1 cm的TPC中的表達量低于腫瘤>1 cm的TPC，并且具有顯著性意義(P=0.018)。同時發(fā)現(xiàn)伴有腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者C-src mRNA的表達量高于不伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者，差異具有顯著性意義(P=0.033)。Kudo Y等[10]研究顯示Scr能夠促進并介導(dǎo)頭頸部癌的淋巴管轉(zhuǎn)移。結(jié)合本研究結(jié)果，認(rèn)為C-src基因促進了TPC的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，C-src mRNA的表達增強可作為TPC臨床預(yù)后判斷的一個分子標(biāo)志。

本實驗發(fā)現(xiàn)，C-src mRNA和C-met mRNA在TPC中的表達呈正相關(guān)，隨著C-met mRNA的表達量增加，C-src mRNA的表達量也逐漸增加，說明在TPC中C-met的過表達也可以活化C-src，進而介導(dǎo)腫瘤的發(fā)生發(fā)展。在一項大腸癌的研究中表明，C-src對C-met 的激活起輔助作用，C-met則是可能進一步加強C-src 的活化，從而發(fā)現(xiàn)C-src和C-met 之間是相互作用的關(guān)系[11]。Src抑制劑AZD0530的實驗發(fā)現(xiàn)C-src在C-met啟動腫瘤發(fā)生的下游通路中發(fā)揮作用，C-met高表達的腫瘤中靶向治療C-src可能獲得療效[12]。但目前國內(nèi)外對C-met和C-src在甲狀腺乳頭狀癌中的擴增和活化的臨床應(yīng)用研究較少，隨著C-met和C-src作為細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的重要因素及其二者的相互作用關(guān)系的進一步研究，C-met mRNA和C-src mRNA可能成為甲狀腺乳頭狀癌預(yù)后評估和靶向治療的新指標(biāo)。

[1] Bittner M,Meltzer P,Chen Y, et al. Molecular classification of cutaneous malignant melanoma by gene expression profiling[J].Nature,2000,406(6795):536-540.

[2] Chen HT,Tsou HK,Chang CH, et al. Hepatocyte growth factor increases osteopontin expression in human osteoblasts through PI3K,Akt,c-src, and AP-1 signaling pathway[J].PLoS One,2012,7(6):e38378.

[3] Bedewy M,El-Maghraby S,Bedewy A. CD163 and c-met expression in the lymph node and the correlations between elevated levels of serum free light chain and the different clinicopathological parameters of advanced classical Hodgkin ＇s lymphoma[J]. Blood Res,2013,48(2):121-127.

[4] Stabile LP,He G,Lui VW, et al. c-src activation mediates erlotinibresistance in head and neck cancer by stimulating c-met[J]. Clin Cancer Res,2013,19(2):380-392.

[5] Lin TH,Tan TW,Tsai TH, et al. D-pinitol Inhibits prostate cancer metastasis through inhibition of αVβ3 integrin by modulating FAK, c-src and NF-κB pathways[J]. Int J Mol Sci,2013,14 (5):9790-9802.

[6] Ruggeri RM,Vitarelli E,Barresi G,et al. HGF/c-met system pathways in benign and malignant histotypes of thyroid nodules:An immunohistochemical characterization[J]. Histol Histopathol,2012,27(1):113-121.

[7] Müller S, Nowak K. Exploring the miRNA-mRNA Regulatory Network in Clear Cell Renal Cell Carcinomas by Next-Generation Sequencing Expression Profiles[J]. Biomed Res Int, 2014,2014:948408.

[8] Henderson YC,Toro-Serra R,Chen Y, et al. Src inhibitors in suppression of papillary thyroid carcinoma growth[J]. Head Neck,2014,36(3):375-384.

[9] Bertotti A,Bracco C,Girolam F, et al. Inhibition of src impairs the growth of met-addicted gastric tumors[J]. Clin Cancer Res,2010,16(15):3933-3943.

[10] Kudo Y, Iizuka S,Yoshida M, et al. Periostin directly and indirectly promotes tumor lymphangiogenesis of head and neck cancer[J].PLoS One,2012,7(8):e44488.

[11] Leroy C,Fialin C,Sirvent A, et al. Quantitative phosphoproteomics reveals a cluster of tyrosine kinases that mediates SRC invasive activity in advanced colon carcinoma cells[J]. Cancer Res,2009,69(6):2279-2286.

[12] Leroy C, Fialin C, Sirvent A,et al. Quantitative phosphoproteomics reveals a cluster of tyrosine kinases that mediates SRC invasive activity in advanced colon carcinoma cells[J].Cancer Res，2009,69(6):2279-2286.

Expressions of C-met mRNA and C-src mRNA in papillary thyroid cancer and their relationship with clinicopathological features

SUN Ying1, TIAN Yun-xiao1, WANG Shuang-hai2, YANG Xin-shun3, ZHAO Xiang-rong1,XIN Li-hui1, NIU Guang-xu1, GUO Xiao-juan1

(1.DepartmentofPathology,HandanCentralHospital,Handan056003,China;2.DepartmentofAnesthesiology,FeixiangCountyHospital,Handan057550,China; 3.DepartmentofRadiotherapy,HandanCentralHospital,Handan056003,China)

Objective To study the expressions of C-src mRNA and C-met mRNA in thyroid papillary cancer (TPC) and to analyze the relationship between their expressions and clinicopathological features. Methods Reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) technique was used to examine the expressions of C-src mRNA and C-met mRNA in 46 TPCs and 18 benign thyroid tissues. The relationship between their expressions and clinicopathological features was analyzed. Results C-met mRNA and C-src mRNA expression levels in 46 TPCs were 1.140±0.163 and 0.984±0.187 respectively. Both were significantly higher than benign thyroid tissues (P<0.001,P<0.001). C-src mRNA expression in TPC was associated with tumor grades and lymph node metastasis (P<0.05,P<0.05). C-met mRNA expression has an ascending trend with aging (P<0.05). C-src mRNA expression closely related to C-met mRNA expression (r=0.764,P<0.001). Conclusion The abnormal expressions of C-src mRNA and C-met mRNA could play a role in the carcinogenesis and development of TPC.

thyroid tumor; papillary cancer; C-src mRNA; C-met mRNA; reverse transcription polymerase chain reaction

論著10.11724/jdmu.2015.03.04

河北省邯鄲市科技局項目(1323108124)

孫 穎(1976-)，女，吉林通化人，主治醫(yī)師。E-mail：symwf@163.com

R736.1

A

1671-7295(2015)03-0223-04

2015-01-04；

2015-04-28)