于曉紅，李書丹，闞洪敏，宋　娜，孫　力（.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，哈爾濱50040；.西安市第八醫(yī)院，西安70060；.哈爾濱市兒童醫(yī)院，哈爾濱5000）

紅樹莓原液對免疫抑制小鼠臟器指數(shù)及血清IFN-γ、IL-4水平的影響

于曉紅1，李書丹1，闞洪敏2，宋娜3，孫力1
（1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，哈爾濱150040；2.西安市第八醫(yī)院，西安710060；3.哈爾濱市兒童醫(yī)院，哈爾濱150010）

［目的］觀察紅樹莓原液對免疫抑制小鼠的免疫調(diào)節(jié)作用，探討紅樹莓原液提高機(jī)體免疫功能的作用機(jī)制。［方法］測定紅樹莓原液對免疫抑制小鼠脾臟、胸腺指數(shù)的影響。應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測免疫抑制小鼠血清γ-干擾素（IFN-γ）、白介素-4（IL-4）水平及計算IFN-γ/IL-4比值。［結(jié)果］紅樹莓原液對免疫抑制小鼠脾臟和胸腺指數(shù)下降有明顯抑制作用，可顯著提高小鼠血清IFN-γ、IL-4水平，降低IFN-γ/IL-4比值。［結(jié)論］紅樹莓原液對免疫抑制小鼠具有免疫增強(qiáng)作用。

紅樹莓原液；免疫抑制；臟器指數(shù)；γ-干擾素；白介素-4

DOI：10.11656/j.issn.1672-1519.2015.03.11

紅樹莓，薔薇科Rasaceae懸鉤子屬Rubus．L半灌木性聚合漿果植物，作為中藥材應(yīng)用已有數(shù)千年的歷史，是中藥覆盆子家族的一員，俗稱“托盤”、“刺莓”等。藥典記載：覆盆子甘、酸、溫；歸肝、腎、膀胱經(jīng)；有益腎固精縮尿，養(yǎng)肝明目之效。民間紅樹莓也被廣泛食用，其果實(shí)柔嫩多汁，酸甜可口，具有止渴、活血及抗腫瘤等功效，已被人們作為良好的防病保健水果。目前對于紅樹莓的研究大多集中于其有效成分的開發(fā)或致力于國內(nèi)種植方法的研究等［1-4］，而對于其免疫藥理作用研究未見報道。基于本課題組前期研究基礎(chǔ)，依據(jù)紅樹莓新鮮果實(shí)中含有多種生物活性物質(zhì)，推斷紅樹莓作用于生物體將產(chǎn)生一定的免疫藥理作用，此項(xiàng)研究將擁有廣闊發(fā)展前景［5-7］。本課題組就紅樹莓對機(jī)體免疫調(diào)節(jié)機(jī)制從分子、基因等水平進(jìn)行了一系列的實(shí)驗(yàn)研究，本研究擬就紅樹莓原液對免疫抑制模型小鼠臟器指數(shù)、血清Th1、Th2型細(xì)胞因子含量的影響進(jìn)行前期報道，旨在闡述紅樹莓原液對機(jī)體的免疫調(diào)節(jié)作用，關(guān)于其他免疫學(xué)指標(biāo)的測定及免疫機(jī)制的研究課題組將陸續(xù)加以報道。

1　實(shí)驗(yàn)材料

1.1實(shí)驗(yàn)動物及分組選用健康昆明系小鼠60只（購于黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心，許可證號：黑醫(yī)實(shí)驗(yàn)動物單項(xiàng)準(zhǔn)第61號。雌雄各半，體質(zhì)量為（18.0±2.0）g，采用隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分成6組，每組10只，分別為正常對照組、模型組、陽性對照組（甘露聚糖肽4 mg/kg）、紅樹莓原液低劑量組（10 g/kg）、紅樹莓原液中劑量組（20 g/kg）、紅樹莓原液高劑量組（40 g/kg）。

1.2藥物1）紅樹莓原液：紅樹莓采摘于黑龍江省尚志市帽兒山，鮮果洗凈、自然干燥、搗碎（不添加蒸餾水）、抽濾去滓，獲得濃度為1.1 g/mL紅樹莓原液。臨用時倍比稀釋成不同濃度的紅樹莓液。2）環(huán)磷酰胺注射液：購于江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司（批號：H32026196）。3）甘露聚糖肽：購于貴州神奇制藥有限公司（批號：H52020862）。

1.3主要試劑小鼠γ-干擾素（IFN-γ）、白介素-4 （IL-4）檢測試劑盒購于武漢博士德生物工程有限公司，蒸餾水、生理鹽水、PBS粉等均購于哈爾濱博潤生物科技公司。

2　實(shí)驗(yàn)方法

2.1給藥方法及劑量自實(shí)驗(yàn)第1日起，紅樹莓原液低、中、高劑量組分別給予稀釋不同濃度的紅樹莓藥液0.4 mL/d灌胃，正常對照組和模型組給予蒸餾水0.4 mL/d灌胃，陽性對照組給予甘露聚糖肽0.4 mL/d灌胃，連續(xù)30 d，灌胃期間自由進(jìn)食。

2.2動物模型制備除正常對照組外，其余各組均于實(shí)驗(yàn)第9日起腹腔注射環(huán)磷酰胺50 mg/kg，隔日注射，連續(xù)22 d，共注射11次，正常對照組同法給予生理鹽水腹腔注射。

2.3標(biāo)本采集及檢測

2.3.1紅樹莓原液對免疫抑制小鼠免疫器官的測定將剝離的胸腺和脾臟，用電子分析天平稱質(zhì)量，按公式計算胸腺指數(shù)和脾指數(shù)。臟器指數(shù)=臟器濕重/小鼠體質(zhì)量。

2.3.2紅樹莓原液對免疫抑制小鼠血清Th1、Th2型細(xì)胞因子的測定于末次給藥后12 h，摘眼球取血約0.6～1.0 mL，靜置30 min，離心（3 000 r/min，15 min），取上清液，移入EP管中，采用酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）法檢測血清中IFN-γ、IL-4水平，嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算血清中IFN-γ、IL-4含量。

2.4統(tǒng)計學(xué)方法數(shù)據(jù)采用統(tǒng)計軟件SPSS18.0處理，計量資料以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，計量資料組間比較采用單因素方差分析（one-way-ANOVA），組間兩兩比較，若方差齊采用LSD法，若方差不齊采用Dunnett’s T3法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3　實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1紅樹莓原液對免疫抑制小鼠胸腺、脾臟指數(shù)的影響與正常對照組比較，模型組胸腺指數(shù)、脾指數(shù)均明顯降低，具有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.01）；與模型組比較，陽性對照組與紅樹莓原液中劑量組均可以升高胸腺指數(shù)、脾指數(shù)，具有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05或P＜0.01），紅樹莓原液低劑量組亦可顯著升高脾指數(shù)，具有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.01）；紅樹莓原液不同劑量組與陽性對照組比較均無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）；紅樹莓原液中劑量組胸腺指數(shù)高于紅樹莓原液低劑量組及紅樹莓原液高劑量組，具有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05），紅樹莓原液不同劑量組脾指數(shù)比較，均無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）。見表1。

表1　小鼠胸腺指數(shù)、脾指數(shù)比較Tab.1　Comparison of the thymus and spleen indexmg/g

表1　小鼠胸腺指數(shù)、脾指數(shù)比較Tab.1　Comparison of the thymus and spleen indexmg/g

注：與正常對照組比較，*P＜0.01；與模型組比較，▲P＜0.01，▲▲P＜0.05；紅樹莓原液各組間比較，#P＜0.01，##P＜0.05。

組別n胸腺指數(shù)脾指數(shù)正常對照組101.490±0.4126.580±1.758模型組100.400±0.205*3.460±0.753*陽性對照組100.680±0.213▲▲4.820±1.141▲低劑量組100.500±0.1864.460±0.802▲中劑量組100.680±0.180▲▲##4.660±1.274▲高劑量組100.500±0.1953.930±0.892

3.2紅樹莓原液對免疫抑制小鼠血清Th1、Th2型細(xì)胞因子的影響紅樹莓原液對免疫抑制小鼠血清中IFN-γ、IL-4及IFN-γ/IL-4比值的影響見表2，結(jié)果表明，模型組IFN-γ、IL-4含量明顯低于正常對照組，比較有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.01），經(jīng)紅樹莓原液給藥后，IFN-γ、IL-4水平均呈現(xiàn)升高趨勢，與模型組比較有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.01或P＜0.05）；與正常對照組比較，模型組小鼠血清IFN-γ/IL-4比值明顯升高，比較有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05），經(jīng)紅樹莓原液給藥后，小鼠血清IFN-γ/IL-4比值呈下降趨勢，與模型組比較有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.01或P＜0.05）；其中紅樹莓原液中劑量組對以上指標(biāo)療效均接近陽性對照組，比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

表2　紅樹莓原液對血清IFN-γ、IL-4含量及IFN-γ/IL-4比值的影響Tab.2　Measuring the effect of Red Raspberries juice on serum IFN-γ，IL-4 content and the ratio of IFN-γ/IL-4

表2　紅樹莓原液對血清IFN-γ、IL-4含量及IFN-γ/IL-4比值的影響Tab.2　Measuring the effect of Red Raspberries juice on serum IFN-γ，IL-4 content and the ratio of IFN-γ/IL-4

注：與正常對照組比較，*P＜0.01，**P＜0.05；與模型組比較，▲P＜0.01，▲▲P＜0.05；與陽性對照組比較，△P＜0.01，△△P＜0.05。

組別nIFN-γ（ng/L）IL-4（ng/L）IFN-γ/IL-4正常對照組10 62.700±8.34322.460±3.1182.830±0.482模型組10 30.980±3.630*8.140±1.759*3.960±0.902**陽性對照組10 52.180±7.886▲20.820±3.675▲2.600±0.733▲低劑量組10 47.300±5.213▲12.890±2.607▲△3.850±1.115▲△中劑量組10 53.790±7.833▲18.620±3.135▲2.910±0.255▲▲高劑量組10 43.570±4.731▲▲△△11.670±3.220▲▲△4.020±1.301▲▲△

4　討論

許多疾病的發(fā)生、發(fā)展與機(jī)體免疫功能下降密切相關(guān)。機(jī)體的免疫系統(tǒng)是一個巨大的網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)，有賴于免疫器官、組織、細(xì)胞和分子等的協(xié)調(diào)作用。本實(shí)驗(yàn)通過觀察小鼠免疫器官（胸腺、脾臟）的生長發(fā)育情況，計算其臟器指數(shù)，初步反映出紅樹莓原液對免疫抑制機(jī)體的免疫調(diào)節(jié)作用［8-10］。結(jié)果顯示：紅樹莓原液中劑量組對免疫抑制小鼠的胸腺發(fā)育有一定促進(jìn)作用，與模型組比較有統(tǒng)計學(xué)差異；紅樹莓原液低劑量組及紅樹莓原液中劑量組對免疫抑制小鼠的脾臟發(fā)育具有明顯的促進(jìn)作用，與模型組比較有統(tǒng)計學(xué)差異。以上結(jié)果表明紅樹莓原液可通過促進(jìn)小鼠胸腺及脾臟等免疫器官的發(fā)育，起到上調(diào)免疫功能的作用［11-12］。

免疫細(xì)胞可通過誘導(dǎo)而合成、分泌細(xì)胞因子等生物活性物質(zhì)，在人體生理、病理過程中發(fā)揮重要作用，并且參與調(diào)節(jié)免疫平衡。根據(jù)CD4+T細(xì)胞所產(chǎn)生的細(xì)胞因子種類和介導(dǎo)功能的不同，可將其分為TH1、TH2和Tr細(xì)胞。TH1型細(xì)胞主要分泌IFN-γ、IL-2、IL-12和TNF-β/α等TH1型細(xì)胞因子，TH2型細(xì)胞主要分泌IL-4、IL-5、IL-6和IL-10等TH2型細(xì)胞因子，TH1、TH2型細(xì)胞因子是否維持平衡狀態(tài)是機(jī)體免疫功能發(fā)揮正常與否的重要因素［13-15］。在TH1/TH2平衡失調(diào)中以TH1或TH2型細(xì)胞因子的優(yōu)勢應(yīng)答均可誘發(fā)疾?。?6-18］。調(diào)節(jié)TH1/TH2失衡狀態(tài)，在多種疾病的診治過程中將起到重要作用［19-20］。

本實(shí)驗(yàn)對小鼠采取腹腔注射環(huán)磷酰胺方法制備免疫抑制模型，其血清IFN-γ、IL-4水平較正常對照組明顯降低，IFN-γ/IL-4比值較正常對照組明顯升高，成功模擬了免疫抑制機(jī)體TH1/TH2失衡狀態(tài)，給予紅樹莓原液治療后可不同程度升高血清IFN-γ、IL-4含量，并可下調(diào)IFN-γ/IL-4比值，糾正IFN-γ/ IL-4（TH1/TH2）失衡狀態(tài)，并使之恢復(fù)接近正常，說明紅樹莓原液可促進(jìn)血清IFN-γ、IL-4細(xì)胞因子分泌，起到正向免疫調(diào)節(jié)作用，并可通過糾正TH1/TH2失衡，達(dá)到治療免疫抑制性疾病的作用。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)以環(huán)磷酰胺制備免疫抑制模型為基礎(chǔ)，通過觀察紅樹莓原液對小鼠臟器指數(shù)及血清IFN-γ、IL-4水平的影響，初步探討紅樹莓原液的免疫增強(qiáng)作用，為紅樹莓的保健食用及臨床研發(fā)提供理論依據(jù)。

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（本文編輯：高杉，馬曉輝）

Influence of Red Raspberry on IFN-γ，IL-4 levels and immunosuppressed mice organs index

YU Xiao-hong1，LI Shu-dan1，KAN Hong-min2，SONG Na3，SUN Li1
（1.Heilongjiang University of Chinese Medicine，Harbin 150040，China；2.The No.8 Hospital of Xi’an，Xi’an 710060，China；3.Children’s Hospital of Harbin，Harbin 150010，China）

［Objective］By observing immunosuppressive effects of Red Raspberries juice in immunosuppressed mice，investigate mechanism of Red Raspberry improves immunological function.［Methods］The spleen and thymus index of immunosuppressed mice were detected.The IFN-γ and IL-4 levels of serum in mice were detected by ELISA method and th IFN-γ/IL-4 ratio were calculated.［Results］Red Raspberries juice has significant inhibitory effects on immunosuppressed mice thymus and spleen index declined；and the serum IFN-γ and IL-4 levels were significantly increased，IFN-γ/IL-4 ratio markedly decreased.［Conclusion］Red Raspberries juice had a certain effect on heightening immunity.

Red Raspberries juice；immunosuppression；organs index；IFN-γ；IL-4

R285.5

A

1672-1519（2015）03-0173-03

于曉紅（1958-），女，教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事中醫(yī)藥對機(jī)體免疫調(diào)節(jié)及抗腫瘤作用機(jī)制研究。

孫力，E-mail：sunli@hljucm.net。

（2014-11-02）