高　青，馬東明，胡先同，盧　斌，張瑞峰，馮玉陶，姜希娟（.天津中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院，天津009；.新泰市中醫(yī)院病理科，新泰700；.天津武警后勤學(xué)院附屬醫(yī)院中醫(yī)科，天津006）

銀杏葉提取物對(duì)家兔高膽固醇血癥模型腦組織形態(tài)學(xué)的影響*

高青1，馬東明1，胡先同1，盧斌1，張瑞峰2，馮玉陶3，姜希娟1
（1.天津中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院，天津300193；2.新泰市中醫(yī)院病理科，新泰271200；3.天津武警后勤學(xué)院附屬醫(yī)院中醫(yī)科，天津300162）

［目的］通過高膽固醇血癥家兔模型觀察銀杏葉提取物（EGB761）對(duì)中樞神經(jīng)纖維的影響。［方法］以成年雄性新西蘭大白兔復(fù)制高膽固醇血癥模型，實(shí)驗(yàn)分為4組：對(duì)照組、模型組、陽性藥辛伐他汀組、EGB761組。用蘇木精-伊紅（HE）染色和嗜銀染色法觀察神經(jīng)元及神經(jīng)纖維的形態(tài)學(xué)改變。［結(jié)果］外周膽固醇升高時(shí)，模型組海馬出現(xiàn)較多神經(jīng)元變性、壞死，神經(jīng)纖維纏結(jié)等病理改變。EGB761組變性、壞死的神經(jīng)元明顯少于模型組，細(xì)胞核形態(tài)基本規(guī)則，嗜神經(jīng)現(xiàn)象少見，神經(jīng)纖維纏結(jié)少于模型組。［結(jié)論］EGB761可有效保護(hù)高膽固醇血癥時(shí)神經(jīng)纖維結(jié)構(gòu)的完整性。

銀杏葉提取物；高膽固醇血癥；神經(jīng)纖維

DOI：10.11656/j.issn.1672-1519.2015.03.09

傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為血液中的膽固醇不能穿過血腦屏障，因此無法影響腦膽固醇的含量。近來研究表明高膽固醇飲食與阿爾茲海默癥（AD）有密切關(guān)系，高膽固醇血癥的個(gè)體具有更高的AD易感性［1］。AD是一種以記憶障礙為主，并伴有其他認(rèn)知和精神行為異常為臨床表現(xiàn)的的疾病，是人類最常見的神經(jīng)退行性疾病，病變部位主要在大腦皮質(zhì)及海馬區(qū)域。銀杏葉作為防治神經(jīng)退行性疾病的主要藥物，可以有效降低外周膽固醇水平大量臨床觀察發(fā)現(xiàn)銀杏內(nèi)酯B對(duì)AD療效確切，前期研究表明它對(duì)離體高膽固醇損傷海馬神經(jīng)元存在明確保護(hù)作用，同時(shí)可以降低神經(jīng)元內(nèi)膽固醇水平，干預(yù)神經(jīng)元膽固醇代謝［2-3］。本實(shí)驗(yàn)通過復(fù)制新西蘭兔高膽固醇血癥模型，進(jìn)行蘇木精-伊紅（HE）染色及Glees銀染，觀察高膽固醇血癥對(duì)皮質(zhì)及海馬的形態(tài)學(xué)影響及銀杏葉提取物（EGB761）的干預(yù)作用。

1　材料和方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選擇健康成年雄性新西蘭大白兔共39只，體質(zhì)量為（2 356±212）g，由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2方法

1.2.1復(fù)制高膽固醇血癥動(dòng)物模型所有家兔均給予普通飼料和自來水適應(yīng)喂養(yǎng)2周，飼養(yǎng)條件為溫度（28±2）℃，濕度為37%～48%。2周之后，從中隨機(jī)取出9只作為對(duì)照組，仍然飼以普通飼料及蒸餾水，直到實(shí)驗(yàn)結(jié)束，共需9周。其余30只家兔均采用D.Larry Sparks［4］的造模方法進(jìn)行高膽固醇血癥家兔的造模，即用2%的高膽固醇飼料喂養(yǎng)。高膽固醇飼料的配比為：4%的膽固醇、4%的花生油、92%的基礎(chǔ)飼料。具體飼養(yǎng)方法如下：因家兔不喜進(jìn)食高膽固醇飼料，故每日早晨每只家兔均先飼以50 g高膽固醇飼料，待其全部吃完后再飼以50 g的普通飼料，飲水用蒸餾水。6周之后，通過家兔耳緣靜脈空腹取血，通過測(cè)定其血清總膽固醇的含量來驗(yàn)證造模是否成功。

1.2.2篩選動(dòng)物模型高膽固醇飼料喂養(yǎng)的30只家兔在6周后通過耳緣靜脈空腹取血，用半自動(dòng)生化分析儀測(cè)定血清總膽固醇的含量。血清總膽固醇若高于1 400 mg/dL，則提示高膽固醇血癥模型復(fù)制成功，同時(shí)淘汰血脂未達(dá)到1 400 mg/dL的家兔。

1.2.3實(shí)驗(yàn)分組及給藥方法正常對(duì)照組之外的30只家兔造模成功28只，淘汰2只，將28只造模成功的家兔按隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為3組，即模型組（n=9）、陽性藥辛伐他汀組（n=8）、EGB761組（n= 11）。之后模型組和EGB761組又因高膽固醇血癥導(dǎo)致腦部疾患各死亡1只，因此最終模型組（8只）、陽性藥辛伐他汀組（8只）、EGB761組（10只）。模型組在6周后繼續(xù)給予高膽固醇飼養(yǎng)3周（由于停用膽固醇飼料后，家兔血膽固醇水平會(huì)很快降低，故須繼續(xù)給予高膽固醇飼料）。陽性藥辛伐他汀組給予辛伐他汀每日5mg/kg灌胃3周，其余處理同模型組。EGB761組每日給予EGB761 50 mg/kg灌胃3周，其余處理同模型組。以上各組飲水仍用蒸餾水，上述藥物劑量是按照成人體表面積折算的等效劑量。

1.2.4標(biāo)本處理所有干預(yù)結(jié)束后，用生理鹽水配置濃度為3%的戊巴比妥鈉，經(jīng)家兔耳緣靜脈注射給藥，待麻醉后將家兔固定于兔臺(tái)之上。然后開胸，打開左心室，將輸液器插入主動(dòng)脈并用細(xì)線固定。剪開右心耳，用大量生理鹽水灌流，將血液洗凈。用骨鉗開顱取腦，取出腦后，用鑷子輕輕分離出海馬和皮質(zhì)，皮質(zhì)要去掉白質(zhì)和腦膜。然后將取出的一側(cè)海馬和皮質(zhì)浸入10%甲醛溶液固定，石蠟包埋切片，進(jìn)行HE染色及Glees銀染。

2　結(jié)果

2.1腦組織HE染色組織形態(tài)學(xué)觀察正常對(duì)照組皮質(zhì)及海馬HE染色鏡下顯示：細(xì)胞核呈藍(lán)色或深藍(lán)色，細(xì)胞漿及其他組織呈粉紅色。神經(jīng)細(xì)胞排列緊密、整齊。細(xì)胞核形態(tài)規(guī)則，未見明顯核固縮、腫脹等病理改變。模型組出現(xiàn)較多的細(xì)胞核消失，神經(jīng)元變性、壞死、減少，且有嗜神經(jīng)現(xiàn)象。銀杏葉提取物EGB761組變性、壞死的神經(jīng)元明顯少于模型組，細(xì)胞核形態(tài)基本規(guī)則，嗜神經(jīng)現(xiàn)象少見。辛伐他汀組的情況與銀杏葉提取物EGB761組類似。見圖1。

圖1　HE染色結(jié)果Fig.1HE staining results

2.2腦組織Glees染色組織形態(tài)學(xué)觀察鏡下顯示：正常對(duì)照組皮質(zhì)及海馬在黃色背景下，神經(jīng)元軸突及神經(jīng)纖維呈黑色，無神經(jīng)元纖維聚集纏結(jié)等病理改變。模型組則出現(xiàn)較多神經(jīng)元纖維聚集纏結(jié)的現(xiàn)象。銀杏葉提取物EGB761組神經(jīng)元纖維聚集纏結(jié)的現(xiàn)象少于模型組而多于正常對(duì)照組。辛伐他汀組的情況與銀杏葉提取物EGB761組類似。見圖2。

圖2　Glees染色結(jié)果Fig.2　Glees staining results

3　討論

外周膽固醇不能通過血腦屏障，對(duì)腦膽固醇含量無直接影響［5］。腦內(nèi)膽固醇通過CYP-46代謝途徑、載脂蛋白E結(jié)合途徑、ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)體A1、類固醇激素合成急性調(diào)節(jié)蛋白、膽固醇?；D(zhuǎn)移酶等轉(zhuǎn)運(yùn)途徑維持平衡。腦膽固醇穩(wěn)態(tài)的破壞將誘發(fā)多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病［6］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示高膽固醇血癥可導(dǎo)致神經(jīng)元的變性、壞死，出現(xiàn)嗜神經(jīng)現(xiàn)象及較多神經(jīng)元纖維聚集纏結(jié)的現(xiàn)象。表明外周膽固醇通過一定的機(jī)制破壞了神經(jīng)纖維的正常組織結(jié)構(gòu)。EGB761是中藥銀杏葉提取物標(biāo)準(zhǔn)制劑，具有調(diào)節(jié)血脂的功效，并可有效降低海馬部位的血腦屏障的完整性［7-9］。通過銀杏葉EGB761的干預(yù)后神經(jīng)元變性、壞死明顯減少，嗜神經(jīng)現(xiàn)象及神經(jīng)元纖維聚集纏結(jié)現(xiàn)象少見，與辛伐他汀組類似。表明EGB761有效保護(hù)了高膽固醇血癥時(shí)神經(jīng)纖維結(jié)構(gòu)的完整性，具體機(jī)制有待進(jìn)一步闡明。

［1］孫雯雯，頡賓芳，劉卉，等.高膽固醇血癥在阿爾茲海默病發(fā)生中的作用及藏藥柳茶提取物的治療效應(yīng)［J］.中藥材，2012，35 （4）:569-602.

［2］姜希娟，盧斌，楊琳，等.銀杏內(nèi)酯B對(duì)膽固醇和載脂蛋白E4損傷海馬神經(jīng)元活性和生長(zhǎng)的影響［J］.中國(guó)老年學(xué)雜志，2007，23（3）:203-205.

［3］姜希娟，杜云，楊琳，等.銀杏內(nèi)酯B對(duì)膽固醇和載脂蛋白E4損傷海馬神經(jīng)元凋亡的影響［J］.遼寧中醫(yī)雜志，2007，34（3）: 371-373.

［4］Sparks DL，Kuo YM，Roher A，et al.Alterations of Alzheimer’s disease in the cholester-fed rabbit，including vascular inflammation［J］. Preliminary observations Ann N Y Acad Sci，2000，903:335-441.

［5］Griffiths WJ，Wang Y.Analysis of oxysterol metabolomes［J］.Biochim Biophys Acta，2011，1811（11）:784-799.

［6］和欣，郭振宇，孫紅梅，等.膽固醇代謝異常與神經(jīng)系統(tǒng)疾病關(guān)系的研究進(jìn)展［J］.現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2012，112（36）:7179-7181.

［7］馬東明，張瑞峰，王強(qiáng)，等.銀杏葉提取物EGB761對(duì)高膽固醇家兔肝質(zhì)量和形態(tài)的影響［J］.天津中醫(yī)藥，2009，26（6）:493-494.

［8］王強(qiáng)，姜希娟，范英昌，等.銀杏葉提取物EGB761對(duì)高膽固醇血癥家兔血腦屏障通透性的影響［J］.天津中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2010，27 （1）:30-32.

［9］姜希娟，盧斌，馬東明，等.銀杏葉提取物EGB761對(duì)阿爾茨海默病家兔模型ACAT1和LCAT mRNA表達(dá)的影響［J］.天津中醫(yī)藥，2011，28（1）:59-60.

（本文編輯：馬英，馬曉輝）

Effect of the extract of Ginkgo Biloba in brain tissue morphology in rabbit hypercholesteremia model

GAO Qing1，MA Dong-ming1，HU Xian-tong1，LU Bin1，ZHANG Rui-feng2，F(xiàn)ENG Yu-tao3，JIANG Xi-juan1
（1.School of Integrative Medicine，Tianjin University of Traditional Chinese Medicine，Tianjin 300193，China；2.Department of Pathology，Xintai Hospital of Traditional Chinese Medicine，Xintai 271200，China；3.Department of Traditional Chinese Medicine，Affiliated Hospital of Tianjin Armed Police Logistics College，Tianjin 300162，China）

［Objective］To study the effect of the extract of Ginkgo Biloba 761（EGB 761）on brain tissue morphology in rabbit hypercholesteremia model.［Methods］We built the hypercholesteremia model with male New Zealand white rabbits，which were divided into four groups:the control group，the model group，the simvastatin group，the EGB761 group.Detecting the morphology change of nerve fiber with HE staining and silver staining.［Results］The hippocampus in model group showed neuronal degeneration，necrosis and microfibers tangles while the EGB761 group showed less neuronal degeneration，necrosis and microfibers tangles，and regular nuclear morphometry. ［Conclusion］EGB761 can effectively protect the integrity of the structure of nerve fibers in hypercholesterolemia.

extract of Ginkgo Biloba；hypercholesteremia；nerve fiber

R285.5

A

1672-1519（2015）03-0165-03

*資金項(xiàng)目：高校博士點(diǎn)專項(xiàng)基金資助項(xiàng)目（20101210120008）。

高青（1988-），女，碩士研究生，主要從事干細(xì)胞及心血管疾病方面的研究。

姜希娟，E-mail:xijuanjiang@foxmail.com。

（2014-11-03）