謝海龍　李俊立　萬(wàn)靖　李承彬

T2DM患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中NLRP3-mRNA表達(dá)與并發(fā)頸動(dòng)脈粥樣硬化的相關(guān)性研究

謝海龍李俊立萬(wàn)靖李承彬

作者單位：434020荊州市，長(zhǎng)江大學(xué)研究生院醫(yī)學(xué)院（謝海龍）
434020荊州市，荊州市中心醫(yī)院檢驗(yàn)科（李俊立萬(wàn)靖李承彬）

目的研究炎性小體中含熱蛋白結(jié)構(gòu)域3的NOD樣受體（NLR family，pyrin domain containing 3，NLRP3）在2型糖尿病 （type 2 diabetes mellitus，T2DM）合并頸動(dòng)脈粥樣硬化 （carotid artery atherosclerosis，CAS）患者外周血單核細(xì)胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMCs）中的表達(dá)水平及其與疾病發(fā)生和發(fā)展的相關(guān)性。方法收集2013年6月至12月期間于我院就診的T2DM患者107例、單純CAS患者35例和健康體檢者35例；其中T2DM患者根據(jù)CAS斑塊情況分為單純T2DM組26例、T2DM輕度斑塊組32例、T2DM中度斑塊組38例、T2DM重度斑塊組11例。采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)檢測(cè)各組患者PBMCs中NLRP3-mRNA的表達(dá)水平，并對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。結(jié)果正常對(duì)照組、單純T2DM組、T2DM合并CAS組、單純CAS組中NLRP3-mRNA的相對(duì)表達(dá)量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。單純T2DM組、T2DM合并CAS組、單純CAS組中NLRP3-mRNA的相對(duì)表達(dá)量均高于正常對(duì)照組，且差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05）；T2DM合并CAS組中NLRP3-mRNA的相對(duì)表達(dá)量高于單純T2DM組和單純CAS組，且差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05）。在T2DM合并CAS各組中NLRP3-mRNA的相對(duì)表達(dá)量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＜0.01）。T2DM中度和重度斑塊組中NLRP3-mRNA的相對(duì)表達(dá)量均低于T2DM輕度斑塊組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05）。T2DM合并CAS組中NLRP3-mRNA的相對(duì)表達(dá)量與斑塊成熟程度呈負(fù)相關(guān)（r=-0.70，P＜0.01）。結(jié)論NLRP3-mRNA與T2DM合并CAS的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)。

NLRP3；外周血單個(gè)核細(xì)胞；頸動(dòng)脈粥樣硬化；2型糖尿病；實(shí)時(shí)熒光定量PCR

doi：10.3969/j.issn.1674-7151.2015.01.004

炎性小體中含熱蛋白結(jié)構(gòu)域3的NOD樣受體（NLR family，pyrin domain containing 3，NLRP3）是NLR家族的一員，也是研究最為廣泛的基因之一［1］。NLRP3可被多種刺激物質(zhì)激活，如膽固醇晶體、活性氧等［2］?；罨蟮腘LRP3觸發(fā)NLRP3炎性小體裝配形成一個(gè)大分子復(fù)合物，控制半胱天冬酶1 （caspase-1）的活性，并隨后產(chǎn)生具有生物活性的IL-1β，引起無(wú)菌性炎性反應(yīng)，介導(dǎo)炎癥的發(fā)生和發(fā)展［3］。而炎性學(xué)說(shuō)是關(guān)于動(dòng)脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）發(fā)生發(fā)展的學(xué)說(shuō)之一，也是引發(fā)2型糖尿病（type 2 diabetes mellitus，T2DM）患者心血管病變的學(xué)說(shuō)之一［4，5］。本文研究通過(guò)檢測(cè)T2DM合并頸動(dòng)脈粥樣硬化（carotid artery atherosclerosis，CAS）患者外周血單個(gè)核細(xì)胞 （peripheral blood mononuclear cells，PBMCs）中NLRP3-mRNA的表達(dá)水平，探討NLRP3基因與T2DM并發(fā)CAS的相關(guān)性，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1　資料與方法

1．1臨床資料收集2013年6月至2013年12月期間于我院就診的T2DM患者107例，根據(jù)華盛頓大學(xué)CAS斑塊的超聲分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)將其分為無(wú)斑塊的單純T2DM組（n=26）和有斑塊的T2DM合并CAS組（n=81），后者又分為Ⅰ級(jí)，單側(cè)斑塊≤2.0 mm的T2DM輕度斑塊組（n=32）；Ⅱ級(jí)，單側(cè)斑塊＞2.0 mm或雙側(cè)均有斑塊且其中至少一側(cè)斑塊≤2.0 mm的T2DM中度斑塊組（n=38）；Ⅲ級(jí)，雙側(cè)斑塊均＞2.0 mm的T2DM重度斑塊組（n=11）。選擇同期在我院就診的無(wú)T2DM的CAS患者作為單純CAS組 （n= 35）。另選擇健康體檢者作為正常對(duì)照組（n=35）。各病例組除符合診斷標(biāo)準(zhǔn)外，排除cryopyrin相關(guān)周期熱綜合征、痛風(fēng)、阿爾茨海默癥等炎性疾病。各組受試者間年齡、性別經(jīng)平衡性檢驗(yàn)，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＞0.05），具有可比性。

1．2主要儀器與試劑ABI 7300熒光定量PCR儀（美國(guó) ABI公司）、GENIUS原位 PCR儀 （英國(guó)Techne公司）、Auagra冷凍高速離心機(jī)（貝克曼庫(kù)爾特公司）、TDZ5-WS離心機(jī)（中國(guó)長(zhǎng)沙湘智離心機(jī)儀器有限公司）、DW-40L188低溫保溫箱（中國(guó)青島海爾集團(tuán)）、MINI-6K微型離心機(jī)（中國(guó)珠海黑馬醫(yī)學(xué)儀器有限公司）、UV-1700紫外分光光度計(jì)（島津制作所）、PAC3000高壓電泳儀（伯樂(lè)公司）、XW-80漩渦混勻器（中國(guó)上海醫(yī)大儀器廠）和IE33多普勒彩色超聲診斷儀（飛利浦公司）。淋巴細(xì)胞分離液由北京Solarbio Science公司提供，TRIzon總RNA提取試劑由美國(guó)life technologies公司提供，HIFI-MMLV cDNA第一鏈合成試劑盒與GoidStar TaqMan Mixture（with ROX）試劑盒由北京康為世紀(jì)生物科技有限公司提供。

1．3方法

1．3．1引物設(shè)計(jì)與合成參考文獻(xiàn)［6］的內(nèi)容，在GenBank中搜索人類NLRP3基因序列和人類βactin基因序列，使用primer express v2.0設(shè)計(jì)引物及探針，由美國(guó)life technologies公司合成。NLRP3上游：5＇-TGCCCGTCTGGGTGAGA-3＇，濃度為10 μM，下游：5＇-CCGGTGCTCCTTGATGAGA-3＇，濃度為10 μM；探針：5＇-（FAM）TGAGCCTCAACAAACGCTACACACGACT（DAB）-3＇，濃度為10 μM。β-actin上游：5＇-GCTGTCTGCCTTGGTAGTGGAT-3＇，濃度為10 μM，下游：5＇-GCATCGTCACCACCAAAGC-3＇，濃度為10 μM；探針：5＇-（FAM）ATGGGTCAGGGATGTGCAAGGCA（DAB）-3＇，濃度為10μM。

1．3．2總RNA的提取與逆轉(zhuǎn)錄每2 ml全血加2 ml生理鹽水，混勻后加2 ml淋巴細(xì)胞分離液，取PBMCs，按Trizol試劑盒說(shuō)明書提取總RNA，20 μl DEPC水溶解，通過(guò)OD260/OD280鑒定RNA的純度，瓊脂糖凝膠電泳鑒定RNA的質(zhì)量，均符合要求后按試劑盒操作說(shuō)明進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。20 μl反應(yīng)體系包含2.5 mM dNTP Mix Each 4 μl，Primer Mix 2 μl，5× RT Buffer 4 μl，0.1 M DTT 2 μl，200 U/μL HIFI-MMLV 1 μl，RNase-free water 2 μl，模板5 μl。反應(yīng)條件：42℃50 min、85℃5min。產(chǎn)物-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1．3．3實(shí)時(shí)熒光定量 PCR（real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction，RT-FQ-PCR）檢測(cè)依據(jù)參考文獻(xiàn)［7］所描述的方法，優(yōu)化后進(jìn)行RT-FQ-PCR檢測(cè)。20 μl反應(yīng)體系包含2×Glodstar Taqman Mixture 10 μl，上下游引物及探針各1 μl，逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物5 μl，加入RNase－Free water至20 μl；反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性10 min，95℃30 s，56℃30 s，62℃45 s，10個(gè)循環(huán)，然后95℃15 s，56℃15 s，62 ℃45 s，30個(gè)循環(huán)。所有標(biāo)本均做雙份檢測(cè)，取均值統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，采用雙德?tīng)査ㄓ?jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量，即以對(duì)照組表達(dá)量為參照進(jìn)行計(jì)算，公式如下△△Ct＝（患者目的基因Ct－管家基因Ct）－（對(duì)照組目的基因Ct－管家基因Ct）患者組相對(duì)表達(dá)量＝2－△△Ct

1．4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 18．0統(tǒng)計(jì)軟件處理數(shù)據(jù)，計(jì)量資料采用x±s表示，多組間計(jì)量資料的比較采用方差分析，NLRP3－mRNA相對(duì)表達(dá)量與斑塊成熟度的相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)性分析，以P＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2．1各組間NLRP3－mRNA相對(duì)表達(dá)量檢測(cè)結(jié)果比較各組間NLRP3－mRNA的相對(duì)表達(dá)量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．01）。單純T2DM組、T2DM合并CAS組以及單純CAS組中NLRP3－mRNA的相對(duì)表達(dá)量均高于正常對(duì)照組，且差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0．05）；T2DM合并CAS組中NLRP3－mRNA相對(duì)表達(dá)量高于單純T2DM組和單純CAS組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0．05）；單純T2DM組NLRP3－mRNA相對(duì)表達(dá)量與單純CAS組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0．05），見(jiàn)表1。

表1　各組間NLRP3－mRNA相對(duì)表達(dá)量檢測(cè)結(jié)果比較

表1　各組間NLRP3－mRNA相對(duì)表達(dá)量檢測(cè)結(jié)果比較

注：＊與正常對(duì)照組比較，P＜0．05；○與T2DM合并CAS組比較，P＜0．05

組別　例數(shù)　N L R P 3 －m R N A相對(duì)表達(dá)量正常對(duì)照組　35　1．00±0．08單純T 2 D M組　26　1．70±0．76＊○T 2 D M合并C A S組　81　3．35±0．34＊單純C A S組　35　1．31±0．32＊○F 值P值－－4 0 3 ．1 6 ＜0 ．0 1

2．2在T2DM合并CAS各組間NLRP3－mRNA相對(duì)表達(dá)量檢測(cè)結(jié)果比較三組間NLRP3－mRNA相對(duì)表達(dá)量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．01）。T2DM輕度斑塊組的NLRP3－mRNA相對(duì)表達(dá)量高于中度和重度組，且差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0．05）。T2DM中度和重度斑塊組間NLRP3－mRNA的相對(duì)表達(dá)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0．05），見(jiàn)表2。

2．3T2DM合并CAS組NLRP3－mRNA相對(duì)表達(dá)量與斑塊成熟度的相關(guān)性分析Pearson相關(guān)性分析結(jié)果顯示，T2DM合并CAS患者NLRP3－mRNA的相對(duì)表達(dá)量隨著斑塊成熟度的升高而逐漸降低，二者呈負(fù)相關(guān)關(guān)系（r＝－0．70，P＜0．01），見(jiàn)圖1。

表2　T2DM合并CAS各組間NLRP3－mRNA相對(duì)表達(dá)量檢測(cè)結(jié)果比較

表2　T2DM合并CAS各組間NLRP3－mRNA相對(duì)表達(dá)量檢測(cè)結(jié)果比較

注：＊與T2DM輕度斑塊組比較，P＜0．05

組別　例數(shù)　N L R P 3 －m R N A相對(duì)表達(dá)量T 2 D M輕度斑塊組　32　5．03±1．14 T 2 D M中度斑塊組　38　2．74±1．19＊T 2 D M重度斑塊組　11　2．28±0．62＊F值?。? 5 ．5 3 P值?。 ＜0 ．0 1

圖1　T2DM合并CAS組NLRP3－mRNA相對(duì)表達(dá)量趨勢(shì)圖

3　討論

T2DM是最常見(jiàn)的內(nèi)分泌代謝綜合征，在疾病的發(fā)生和發(fā)展中伴有自發(fā)的炎性反應(yīng)，且易引發(fā)多種并發(fā)癥，其中心血管疾病是最重度的并發(fā)癥之一，也是導(dǎo)致T2DM患者死亡的重要因素［6，7］。NLRP3炎性小體是一種多蛋白復(fù)合物，參與T2DM及其并發(fā)癥的發(fā)生和發(fā)展［8］。NLRP3可被多種物質(zhì)刺激活化，如膽固醇晶體、神經(jīng)酰胺、活性氧、胰島淀粉樣多肽等。NLRP3活化后與凋亡相關(guān)的斑點(diǎn)樣蛋白（apoptosis－associatedspeck－likeproteincontaininga CARD，ASC）結(jié)合，并促使ASC和前半胱天冬酶1 （pro－caspase－1）結(jié)合，形成NLRP3炎性小體［9］。炎性小體活化后，ASC刺激pro－caspase－1使其裂解為有活性的caspase－1。有活性的caspase－1使前白介素pro－IL－1β裂解成為成熟的炎性因子IL－1β并產(chǎn)生炎性反應(yīng)，促使T2DM發(fā)生CAS病變［10］。

本文研究結(jié)果顯示，NLRP3－mRNA在各病例組中均高表達(dá)，且相對(duì)表達(dá)量均顯著高于正常對(duì)照組（P均＜0．05），這與Hermansson等［11］的報(bào)道一致。而且T2DM合并CAS組中NLRP3－mRNA的相對(duì)表達(dá)量顯著高于單純T2DM組和單純CAS組 （P均＜0．05），提示T2DM并發(fā)CAS與NLRP3－mRNA高表達(dá)相關(guān)。具體作用機(jī)制可能是T2DM患者機(jī)體中PBMCs受到胰島淀粉樣多肽或者膽固醇晶體等的刺激，使細(xì)胞內(nèi)NLRP3－mRNA活化，招募ASC及pro－caspase－1形成活化的NLRP3炎性小體，并促使炎性因子成熟和釋放，產(chǎn)生炎癥反應(yīng)。繼而在炎癥的持續(xù)作用下使胰島β細(xì)胞和頸動(dòng)脈發(fā)生病變，導(dǎo)致T2DM和CAS的發(fā)生發(fā)展。本文研究結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，雖然單純T2DM組中NLRP3－mRNA相對(duì)表達(dá)量高于單純CAS組，但這兩組的NLRP3－mRNA相對(duì)表達(dá)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0．05），引起這一結(jié)果的原因仍不清楚，有待進(jìn)一步研究。

本文研究通過(guò)對(duì)T2DM合并不同程度CAS患者NLRP3－mRNA相對(duì)表達(dá)量的檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在斑塊形成的不同時(shí)期，NLRP3－mRNA的相對(duì)表達(dá)量不同，其中T2DM輕度斑塊組表達(dá)量顯著高于中度和重度斑塊組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0．05）。且NLRP3－mRNA的相對(duì)表達(dá)量與CAS斑塊的成熟程度呈負(fù)相關(guān)（r＝－0．70，P＜0．01）。即在CAS斑塊形成初期NLRP3－mRNA的相對(duì)表達(dá)量最高，隨著CAS斑塊的逐漸成熟，NLRP3－mRNA的表達(dá)水平逐漸降低，提示NLRP3－mRNA高表達(dá)，即炎癥增強(qiáng)極有可能是啟動(dòng)T2DM患者CAS斑塊形成的重要因素；而炎癥緩解或斑塊成熟又可使NLRP3－mRNA表達(dá)下調(diào)，但其中的具體機(jī)制尚不十分明確，有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，NLRP3－mRNA高表達(dá)與T2DM并發(fā)CAS的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，檢測(cè)NLRP3－mRNA表達(dá)量可能會(huì)成為診斷、預(yù)防和治療T2DM并發(fā)CAS的新靶點(diǎn)。但連續(xù)檢測(cè)NLRP3－mRNA表達(dá)量評(píng)估T2DM合并CAS病情的具體方法，仍有待進(jìn)一步的研究。

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（本文編輯：楊軍）

The correlation research between the expression of NLRP3-mRNA in patients with type 2 diabetes mellitus and carotid artery atherosclerosis

XIE Hai-long1，LI Jun-li2，WAN Jing2，et al.
1Medical College，the Graduate School of Changjiang University，Jingzhou 434020，China2Department of Clinical Laboratory，the Center Hospital of Jingzhou，Jingzhou 434020，China

ObjectiveTo study the correlation between the expression of NLR family，pyrin domain containing 3（NLRP3）mRNA in peripheral blood mononuclear cells（PBMCs）of patients with type 2 diabetes mellitus（T2DM）and carotid artery atherosclerosis（CAS）.Methods107 cases patients with T2DM，35 cases patients with CAS and 35 cases healthy controls from June 2013 to December 2013 in our hospital were collected.The T2DM patients were divided into T2DM group（26 cases），T2DM combine mild plaque group（32 cases），T2DM combine midrange plaque group（38 cases），and T2DM combine severe plaque group（11 cases）.The expression levels of NLRP3-mRNA in PBMCs in all the groups were detected by real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction，and the results were analyzed statistically.ResultsThere was statistical significance in the difference of NLRP3-mRNA expression level among control group，T2DM group，T2DM combine CAS group and CAS group（P＜0.01）.The NLRP3-mRNA expression levels in T2DM group，T2DM combine CAS group and CAS group were all higher than that of control group，and the differences all had statistical significance（Pall＜0.05）.The NLRP3-mRNA expression level in T2DM combine CAS group was higher than that of T2DM group and CAS group，and the differences all had statistical significance（Pall＜0.05）.There was statistical significance in the difference of NLRP3-mRNA expression level among all the T2DM combine CAS groups（P＜0.01）.The NLRP3-mRNA expression levels in T2DM combine severe plaquegroup and T2DM combine midrange plaque group were all lower than that of T2DM combine mild plaque，and the differences all had statistical significance（Pall＜0.05）.The correlation research results showed that the NLRP3-mRNA expression level was negative correlated with plaque maturation degree（r=-0.70，P＜0.01）. ConclusionThe NLRP3-mRNA is correlated with the occurrence and development of T2DM combine CAS.

NLRP3；Peripheral blood mononuclear cells；Carotid artery atherosclerosis；Type 2 diabetes mellitus；Real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction

荊州市科技局資助項(xiàng)目（2012041）

李承彬，E-mail：jzlcb001@163.com

（2014－12－23）