王占奎，周　震，張琳琳，劉　爽，宋婉珊，郭家奎，張玉蓮

·中藥研究·

補(bǔ)腎中藥有效成分對(duì)SAMP8小鼠氧化應(yīng)激水平的影響*

王占奎，周震，張琳琳，劉爽，宋婉珊，郭家奎，張玉蓮

（天津中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院針灸腦病中心，天津300150）

［目的］觀察補(bǔ)腎中藥有效成分補(bǔ)骨脂素、齊墩果酸、淫羊藿苷對(duì)快速老化（SAMP8）小鼠氧化應(yīng)激水平的影響。［方法］選取9月齡雄性SMAP8小鼠，采用隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為補(bǔ)骨脂素組、齊墩果酸組、淫羊藿苷組及模型組。同時(shí)另取同齡段的抗快速衰老亞系1（SAMR1）小鼠作為對(duì)照組。治療組分別給予補(bǔ)骨脂素（50mg/kg）、齊墩果酸（50mg/kg）、淫羊藿苷（20mg/kg）灌胃，對(duì)照組與模型組均給予等量的生理鹽水灌胃，每次0.3mL，每日1次，連續(xù)灌胃4周后斷頭取腦。采用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（ELISA）法檢測(cè)SMAP8小鼠大腦皮質(zhì)中谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH-Px）、過(guò)氧化氫酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）的含量。［結(jié)果］SMAP8小鼠大腦皮質(zhì)中SOD、CAT和GSH-Px活性較同齡SAMR1小鼠明顯降低，模型組大腦皮質(zhì)SOD、CAT和GSH-Px活性均低于對(duì)照組，經(jīng)4周治療后，治療組大腦皮質(zhì)中SOD、CAT和GSH-Px活性均高于模型組，對(duì)于以上指標(biāo)，補(bǔ)骨脂素、齊墩果酸、淫羊藿苷3種組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。［結(jié)論］補(bǔ)腎中藥對(duì)SAMP8的氧化應(yīng)激損傷具有一定保護(hù)作用，從而可以達(dá)到防治老年性癡呆的作用。

補(bǔ)腎中藥；老年性癡呆；補(bǔ)骨脂素；齊墩果酸；淫羊藿苷；氧化應(yīng)激；SAMP8小鼠

氧化應(yīng)激（OS）是由自由基在體內(nèi)產(chǎn)生的一種負(fù)面作用，被認(rèn)為是導(dǎo)致衰老和疾病的一個(gè)重要因素。大腦神經(jīng)元的膜結(jié)構(gòu)是由高濃度的不飽和脂肪酸組成，由于神經(jīng)元的谷胱甘肽含量較少，只含有中等量抗氧化酶，所以極易被氧化，且清除自由基的能力相對(duì)較弱［1］，對(duì)氧化應(yīng)激也特別敏感［2］。氧化應(yīng)激是阿爾茨海默癥（AD）發(fā)病的重要假說(shuō)之一，與AD有著密切關(guān)系，如果體內(nèi)氧化還原平衡遭到破壞，多余的氧自由基會(huì)對(duì)身體造成氧化損傷，而這種氧化損傷直接參與了AD等多種神經(jīng)退行性疾病的病理過(guò)程［3］。

快速老化（SAMP8）小鼠在幼年時(shí)就出現(xiàn)較高的氧化應(yīng)激水平，腦中脂質(zhì)過(guò)氧化物和過(guò)氧化氫產(chǎn)生增加，活性氧高度敏感谷氨酰胺合酶的活性降低，而給予抗氧化劑后，可使其記憶障礙得到明顯改善［4-5］。補(bǔ)腎中藥防治老年性癡呆有著重要的作用［6-7］。因此，本研究利用補(bǔ)腎中藥這一天然的抗氧化劑，觀察補(bǔ)腎中藥補(bǔ)骨脂、女貞子和淫羊藿的有效成分補(bǔ)骨脂素、齊墩果酸、淫羊藿苷對(duì)SAMP8小鼠谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH-Px）、過(guò)氧化氫酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）的影響，探討其調(diào)整抗氧化應(yīng)激系統(tǒng)功能紊亂可能的作用機(jī)制，為補(bǔ)腎中藥防治老年性癡呆提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1　材料和方法

1.1動(dòng)物及分組選擇40只9月齡健康SAMP8小鼠，雄性，體質(zhì)量（30±2）g，小鼠購(gòu)自天津市針灸研究所老化鼠繁育中心。采用隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為補(bǔ)骨脂素組、淫羊藿苷組、齊墩果酸組及模型組4組，每組10只小鼠。另取10只同齡段的抗快速衰老亞系1（SAMR1）小鼠作為對(duì)照組。所有小鼠飼養(yǎng)于SPF動(dòng)物房。進(jìn)食方式為自由進(jìn)食，每周更換鼠籠1次。

1.2藥物配制和干預(yù)將補(bǔ)骨脂素、齊墩果酸、淫羊藿苷單體用研缽研磨后，混懸于生理鹽水中，制成5 g/L補(bǔ)骨脂素懸液、5 g/L齊墩果酸和2 g/L淫羊藿苷懸液，其濃度為補(bǔ)骨脂素50mg/kg，齊墩果酸50mg/kg，淫羊藿苷20mg/kg，治療組分別給予補(bǔ)骨脂素、齊墩果酸、淫羊藿苷灌胃治療，連續(xù)灌胃4周，每次0.3mL，每日1次。對(duì)照組與模型組均用等體積0.9%氯化鈉注射液灌胃。

1.3儀器和試劑Infinite 200PRO酶標(biāo)儀（Tecan Austria GmbH），臺(tái)式冷凍離心機(jī)（德國(guó)Universal 16R），1/10000電子分析天平（瑞士Mettler AE100）。SOD、GSH-Px、CAT活性測(cè)定試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所。

1.4組織標(biāo)本提取連續(xù)灌胃4周后，小鼠頸椎脫臼處死，于冰臺(tái)上迅速剝離大腦組織，4℃預(yù)冷的生理鹽水漂洗，濾紙吸干多余水分后置于電子天平上稱(chēng)質(zhì)量，按1∶9（質(zhì)量/體積）加入冰冷生理鹽水，用高速分散勻質(zhì)機(jī)制成10%的腦勻漿，取上清液，采用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（ELISA）法測(cè)定GSH-Px、SOD、CAT活性水平，嚴(yán)格按照試劑盒操作說(shuō)明進(jìn)行各指標(biāo)測(cè)定。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行處理，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，計(jì)量資料先進(jìn)行正態(tài)分布檢驗(yàn)，符合正態(tài)分布者，多組組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較時(shí)，若方差齊，采用LSD法，若方差不齊，則采用Dunnett’s T3法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

SMAP8小鼠大腦皮質(zhì)中的 SOD、CAT和GSH-Px活性較同齡SAMR1小鼠明顯降低，說(shuō)明SMAP8小鼠在9月齡就出現(xiàn)較高的氧化應(yīng)激水平，與同齡SAMR1小鼠相比，模型組SOD、CAT和GSH-Px活性均低于對(duì)照組，說(shuō)明模型組SOD、CAT和GSH-Px協(xié)同清除能力的下降加劇了氧化應(yīng)激損傷，導(dǎo)致抗氧化防御體系全面下降。經(jīng)4周治療后，治療組SOD、CAT和GSH-Px活性較模型組顯著升高，對(duì)于以上指標(biāo)，補(bǔ)骨脂素、齊墩果酸、淫羊藿苷3組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），表明補(bǔ)骨脂素、齊墩果酸、淫羊藿苷3種補(bǔ)腎中藥對(duì)SAMP8小鼠的氧化應(yīng)激損傷具有很好的拮抗作用。見(jiàn)表1-3。

表1　各組小鼠腦組織SOD活性比較（±s）Tab.1　Com parison of SOD activity in brain tissue ofm ice ofeach group（±s）nU/mg

表1　各組小鼠腦組織SOD活性比較（±s）Tab.1　Com parison of SOD activity in brain tissue ofm ice ofeach group（±s）nU/mg

注：與對(duì)照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05。

組別　n　SOD模型組　10　18.45±1.55*對(duì)照組　10　27.95±1.68#淫羊藿苷組　10　24.04±1.98#補(bǔ)骨脂素組　10　23.94±1.87#齊墩果酸組　10　23.63±2.15#

表2　各組小鼠腦組織GSH-Px活性比較（±s）Tab.2　Com parison ofGSH-Px activity in brain tissueof m ice of each group（±s）U/mg

表2　各組小鼠腦組織GSH-Px活性比較（±s）Tab.2　Com parison ofGSH-Px activity in brain tissueof m ice of each group（±s）U/mg

注：與對(duì)照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05。

組別　n　GSH-Px模型組　10　1.44±0.13*對(duì)照組　10　1.93±0.10#淫羊藿苷組　10　1.79±0.23#補(bǔ)骨脂素組　10　1.81±0.13#齊墩果酸組　10　1.83±0.12#

表3　各組小鼠腦組織CAT活性比較（±s）Tab.3　Comparison of CAT activity in brain tissueofm ice of each group（±s）U/mg

表3　各組小鼠腦組織CAT活性比較（±s）Tab.3　Comparison of CAT activity in brain tissueofm ice of each group（±s）U/mg

注：與對(duì)照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05。

組別　n　CAT模型組　10　05.39±0.65*對(duì)照組　10　11.17±0.95#淫羊藿苷組　10　09.86±0.88*#補(bǔ)骨脂素組　10　10.80±1.32#齊墩果酸組　10　09.64±1.13#

3　討論

SAMP8小鼠具備均一的遺傳背景和穩(wěn)定老化病態(tài)特征，在早期就出現(xiàn)Aβ異常沉積、tau蛋白磷酸化、學(xué)習(xí)記憶功能障礙、神經(jīng)遞質(zhì)改變、突觸結(jié)構(gòu)和功能障礙等多方面的特征性改變，在成熟期（4～6個(gè)月）過(guò)后發(fā)生了快速老化，其快速老化自然產(chǎn)生，與臨床癡呆的漸進(jìn)性發(fā)生極為相似，是目前研究衰老和老年性癡呆的較為理想的動(dòng)物模型［8-9］。

采用“補(bǔ)腎生精”法治療“癡呆”、“善忘”這類(lèi)疾病，在延緩和控制疾病的發(fā)展上有一定的療效［7］。中草藥或植物提取物來(lái)源廣泛、效果明顯、毒副作用低，并且含有豐富的活性多糖成分，在抗氧化、抗衰老等方面有著重要作用。研究表明，補(bǔ)腎中藥有效成分淫羊藿苷、補(bǔ)骨脂素、齊墩果酸3種補(bǔ)腎中藥有效成分能對(duì)抗自由基，抑制脂質(zhì)過(guò)氧化物，有膜穩(wěn)定及抗氧化保護(hù)作用，均對(duì)AD造成的神經(jīng)元損傷具有保護(hù)作用，可下調(diào)SAMP8小鼠海馬組織APP及PS1基因的表達(dá)，進(jìn)而達(dá)到治療老年性癡呆作用［10-11］。

氧化應(yīng)激的發(fā)生與AD密切相關(guān)，AD的發(fā)生涉及到位于Aβ斑塊附近的小膠質(zhì)細(xì)胞激活，產(chǎn)生活性氧，通過(guò)模式識(shí)別受體與非模式識(shí)別受體介導(dǎo)的無(wú)菌炎癥反應(yīng)和促炎癥因子的釋放［12］?？寡趸深A(yù)已廣泛應(yīng)用于衰老及衰老相關(guān)疾病的防治，已取得了較大進(jìn)展［13］。通過(guò)抗氧化干預(yù)，機(jī)體內(nèi)不但炎性反應(yīng)較低，且伴以有效的抗炎網(wǎng)絡(luò)，從而可充分中和氧化應(yīng)激損傷相關(guān)的分子模式介導(dǎo)的慢性炎癥復(fù)合物［14］。老年大鼠由于維持穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)系統(tǒng)衰老，體內(nèi)存在促炎細(xì)胞因子表達(dá)上調(diào)，導(dǎo)致促-抗炎細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)和促-抗炎性反應(yīng)體系平衡失調(diào)，而采用中藥淫羊藿總黃酮和淫羊藿苷可通過(guò)下調(diào)內(nèi)源性促炎性細(xì)胞因子的表達(dá)和上調(diào)內(nèi)源性抗炎性細(xì)胞因子的表達(dá)，重塑促-抗炎性細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)和促-抗炎性反應(yīng)體系新的平衡，達(dá)到干預(yù)炎性衰老的目的［15］。而ICA改善SAMP8小鼠學(xué)習(xí)記憶的作用與其抗氧化活性有關(guān)［16］。

SAMP8小鼠的學(xué)習(xí)記憶障礙發(fā)病機(jī)制與其腦中異常的氧化應(yīng)激有關(guān)。SAMP8小鼠在幼年時(shí)體內(nèi)的代謝速度隨之加快，處于較高的氧化-還原失衡的氧化應(yīng)激狀態(tài)。機(jī)體氧化應(yīng)激導(dǎo)致細(xì)胞功能異常，是誘發(fā)多種疾病的重要原因之一。抗氧化劑通過(guò)抑制或減緩自由基的生成對(duì)修復(fù)機(jī)體的氧化損傷有重要的作用［17］。中藥有效成分具有明確的抗氧化作用，可顯著增強(qiáng)SAMP8小鼠大腦皮質(zhì)和血清中氧化物質(zhì)的活性以清除氧自由基，抑制脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，減輕或緩解氧化損害［18］。這與減少小膠質(zhì)細(xì)胞活化和單核巨噬細(xì)胞在損傷部位積聚等有關(guān)［19］。本研究結(jié)果表明，模型組SOD、CAT和GSH-Px活性均低于對(duì)照組，說(shuō)明模型組小鼠的SOD、CAT和GSH-Px協(xié)同清除能力的下降加劇了氧化應(yīng)激損傷，與AD的發(fā)生具有密切關(guān)系。治療組小鼠SOD、CAT和GSH-Px活性均高于模型組，表明淫羊藿苷、補(bǔ)骨脂素、齊墩果酸3種補(bǔ)腎中藥對(duì)SAMP8小鼠的氧化應(yīng)激損傷具有一定保護(hù)作用。中藥有效成分對(duì)快速老化癡呆模型所致的SOD、GSH-Px和CAT水平低下具有保護(hù)作用，使SOD、GSH-Px和CAT水平升高，增強(qiáng)機(jī)體抗氧化能力，清除自由基而發(fā)揮其抗癡呆、延緩衰老的作用［20］。本研究還發(fā)現(xiàn)治療組SOD、GSH-Px和CAT活性仍低于對(duì)照組，表明補(bǔ)腎中藥有效成分并不能完全消除SAMP8小鼠的氧化應(yīng)激損傷。因此，臨床上治療AD時(shí)，尚需結(jié)合其他藥物或手段以及長(zhǎng)期系統(tǒng)的進(jìn)行治療。

預(yù)防醫(yī)學(xué)研究前沿“氧化應(yīng)激窗口理論”指出，如果能在氧化應(yīng)激窗口期進(jìn)行預(yù)防醫(yī)學(xué)干預(yù)及臨床藥物干預(yù)，就能避免氧化應(yīng)激對(duì)機(jī)體造成疾病傷害。說(shuō)明疾病預(yù)防的干預(yù)時(shí)期非常重要。錯(cuò)過(guò)了預(yù)防時(shí)機(jī)，將增加疾病風(fēng)險(xiǎn)，也給治療帶來(lái)困難。因此，針對(duì)氧化應(yīng)激的預(yù)防、修復(fù)和防御等措施也在不斷深入研究，應(yīng)用抗氧化劑進(jìn)行體內(nèi)抗氧化是最有效的手段［21］，這和中醫(yī)“治未病”的未病先防、已病防變、已變防漸等理論是相符的，這也表明了應(yīng)用中醫(yī)藥抗氧化治療AD的廣闊前景。

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（本文編輯：高杉，于春泉）

Effect of effective com ponentsof Chinesem edicine for tonifying kidney on the levelsof oxidative stress in SAM P8m ice

WANGZhan-kui，ZHOU Zhen，ZHANGLin-lin，LIUShuang，SONGWan-shan，GUO Jia-kui，ZHANGYu-lian
（C enter of Acupuncture and Encephalopathy，The Second Affiliated Hospitalof Tianjin University of Traditional Chinese Medicine，Tianjin 300150，Chin a）

［Objective］To observe the effect of effective components in tonifying kidney herbs of psoralen，oleanolic acid，icariin on oxidative stress levelwithmice（SAMP8）.［Methods］Thisexperimentchose september-agedmale SMAP8mice，according to the random number tablemethod were random ly divided into psoralen group，oleanolic acid group，icariin group and model group.At the same time another age segment SAMR1mice were chosen as control group.The treatmentgroup were given psoralen（50mg/kg），oleanolic acid（50mg/kg），icariin（20mg/kg）by gavage，saline controlgroup andmodelgroup were given the same amountof gastric perfusion，0.3mL each time，1 timea day，continuous intragastric administration for4weeks，then the ratswere killed by decapitation and getting thebrain. Using enzyme-linked immunosorbentassay（ELISA）method for detecting the contentsofglutathion peroxidase（GSH-Px），catalase（CAT），superoxide dismutase（SOD）in cerebral cortex of SMAP8.［Results］SOD，CAT and GSH-Px activity in SAMR1micewere decreased compared with age-matched of SMAP8 in the cerebral cortex；cerebral cortex SOD，CAT and GSH-Px activity in themodel group were lower than the controlgroup，after 4 weeksof treatment，SOD，CATand GSH-Px activity in the cerebral cortex of the treatmentgroup were higher than those in themodelgroup，and therewasno significantdifferencebetween psoralen，oleanolic acid，icariin threegroups of the above indicators（P＞0.05）.［Conclusion］The kidney tonifying herbshas certain protective effect on oxidative stress injury in SAMP8，so as toachieve theeffectofprevention and treatmentofsenile dementia.

kidney tonifying herb；senile dementia；psoralen；oleanolic acid；icariin；oxidative stress；SAMP8mice

R285.5

A

1672-1519（2015）02-0102-04

10.11656/j.issn.1672-1519.2015.02.10

國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃（973）計(jì)劃項(xiàng)目（2010CB530405）；國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81102577）。

王占奎（1977-），男，博士，主治醫(yī)師，主要研究方向?yàn)橹形麽t(yī)結(jié)合治療腦病的臨床與基礎(chǔ)研究。

張玉蓮，E-mail：zhyl220@126.com。

（2014-10-12）