孫　璐，劉　睿，趙　雯，李遇伯，張艷軍

苦碟子注射液中4種氨基酸含量的測定*

孫璐，劉睿，趙雯，李遇伯，張艷軍

（天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津300193）

［目的］建立同時(shí)測定苦碟子注射液中4種氨基酸類成分（纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸）含量的2，4-二硝基氟苯（DNFB）柱前衍生化法。［方法］采用DiamonsilC18（2）色譜柱（200mm×4.6mm，5μm）；流動(dòng)相A為超純水，B為pH=6.40的30mmol/L乙酸鈉（含1%N，N-二甲基甲酰胺），C為乙腈，梯度洗脫。流速為1.0m L/min，柱溫25℃，檢測波長為350 nm。［結(jié)果］對(duì)10批苦碟子注射液中4種氨基酸含量進(jìn)行了測定，纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸分別在0.138 8～4.440、0.124 4～3.980、0.135 0～4.320、0.131 9～4.220mg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（r≥0.999 4）。平均回收率分別為98.49%、100.60%、98.50%、98.56%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）≤2.0%（n=6）。［結(jié)論］該方法簡便、準(zhǔn)確，可靠，為苦碟子注射液質(zhì)量控制提供參考。

苦碟子注射液；柱前衍生化；2，4-二硝基氟苯；氨基酸；高效液相色譜法

苦碟子注射液是以抱莖苦荬菜［Ixeris sonchifolia（Bge．）Hance］為原料制成的中藥注射劑，具有抗腫瘤、擴(kuò)冠及改善心肌缺血等功能［1］，在腦梗死、冠心病等治療方面有重要價(jià)值［2-3］。苦碟子注射液的主要成分為氨基酸類和黃酮類［4］，早期研究認(rèn)為這兩種成分具有抗腫瘤作用［5-6］。常用的氨基酸含量測定方法有自動(dòng)分析儀法、高效液相色譜法、毛細(xì)管電泳法等［7］。其中自動(dòng)分析儀法儀器價(jià)格昂貴，毛細(xì)管電泳法方法復(fù)雜，因此筆者采用柱前衍生化法，建立了同時(shí)測定苦碟子注射液中4種氨基酸的分析方法，并對(duì)10批注射液中的氨基酸進(jìn)行了含量測定，為實(shí)際生產(chǎn)中的質(zhì)量控制提供依據(jù)。

1　儀器和材料

Waters-e2695高效液相色譜系統(tǒng)（含四元泵，在線真空脫氣機(jī)，自動(dòng)進(jìn)樣器，柱溫箱，2998光電二極管陣列檢測器，Empower 2色譜工作站，美國Waters公司），BT125D型分析天平［賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司］，THZ-82型水浴恒溫振蕩器（金壇市榮華儀器制造有限公司），KH 2200B型超聲波清洗器（昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司）。

纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸對(duì)照品（中國藥品生物制品檢定所，批號(hào)：140624-200805，所有對(duì)照品純度經(jīng)高效液相色譜峰面積歸一化法計(jì)算均大于99%）。乙腈（色譜純，SIGMA公司），2，4-二硝基氟苯、N，N-二甲基甲酰胺（天津一方科技有限公司），水為超純水，其他試劑均為分析純。

苦碟子注射液（吉林通化華夏藥業(yè)有限公司，批號(hào)：120625、110601、120312、120109、111105、120438、111011、120209、111218、120532）。

2　方法與結(jié)果

2.1混合對(duì)照品溶液的配制精密稱取纈氨酸標(biāo)準(zhǔn)品4.44mg，異亮氨酸標(biāo)準(zhǔn)品3.98mg，亮氨酸標(biāo)準(zhǔn)品4.32mg，苯丙氨酸標(biāo)準(zhǔn)品4.22mg，分別置10mL量瓶中，先加少量80%（V/V）乙醇溶解再定容至刻度，搖勻，即得對(duì)照品儲(chǔ)備液。分別精密吸取對(duì)照品儲(chǔ)備液適量，制成含纈氨酸44.40mg/L、異亮氨酸39.80mg/L、亮氨酸43.20mg/L、苯丙氨酸42.20mg/L的混合對(duì)照品溶液。

2.2供試品溶液的配制精密量取樣品1.00 mL置10mL量瓶中，加5%碳酸氫鈉溶液1.00mL與1%2，4-二硝基氟苯乙腈溶液1.00mL，搖勻，60℃水浴中暗處加熱30 min后取出。用0.01 mol/L KH2PO4溶液定容至10mL，經(jīng)0.45μm微孔濾膜濾過，即得供試品溶液。

2.3色譜條件Diamonsil C18（2）色譜柱（200mm× 4.6mm，5μm），柱溫：25℃；檢測波長：350 nm，流速：1.0mL/min，進(jìn)樣量：10μL。流動(dòng)相A：水；流動(dòng)相B：30mmol/L乙酸鈉（含1%N，N-二甲基甲酰胺），pH 6.40；流動(dòng)相C：乙腈；按“表1”進(jìn)行梯度洗脫。

表1 流動(dòng)相梯度Tab.1　Gradient of them obile phase

2.4專屬性實(shí)驗(yàn)及系統(tǒng)適用性實(shí)驗(yàn)在2.3項(xiàng)色譜條件下，空白溶液，纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸在混合對(duì)照品溶液及苦碟子注射液供試品溶液中的高效液相色譜（HPLC）圖中4種氨基酸分離效果良好。見圖1。

圖1　空白溶液、混合對(duì)照品溶液和供試品溶液的HPLC色譜圖Fig.1　Chromatogramsof blank solution，m ixed standard am ino acidssolution and sam ple solution

2.5線性關(guān)系考察精密吸取2.1項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液1.00mL，加入80%（V/V）乙醇溶液1.00mL，搖勻，再精密量取該稀釋溶液1.00mL，按上述步驟逐級(jí)稀釋，即得混合對(duì)照品的系列對(duì)照溶液。將溶液按2.2項(xiàng)下供試品的制備方法進(jìn)行衍生，然后將溶液按2.3項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測定，記錄色譜圖和峰面積。分別以峰面積（Y?）為縱坐標(biāo)，對(duì)照品濃度（X）為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得出各個(gè)氨基酸的回歸方程及相關(guān)系數(shù)。見表2。

表2　4種氨基酸的回歸方程、相關(guān)系數(shù)及線性范圍Tab.2　Regression equations，correlation coefficien tsand linear rangesof four am ino acids

2.6精密度實(shí)驗(yàn)按2.1項(xiàng)下方法制備含纈氨酸8.880mg/L、異亮氨酸7.960mg/L、亮氨酸8.640mg/L、苯丙氨酸8.440mg/L的混合對(duì)照品溶液，按2.3項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積。纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸峰面積的RSD分別為0.30%、0.39%、0.97%、0.39%，表明儀器精密度良好。

2.7重復(fù)性實(shí)驗(yàn)取6份苦碟子注射液（批號(hào)：110601）1.0mL，按2.2項(xiàng)下方法平行制成供試品溶液，按2.3項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，計(jì)算重復(fù)性。纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸含量分別為0.681 2、0.4159、0.3159、0.2678mg/L，RSD分別為1.3%、1.2%、2.3%、2.0%。結(jié)果表明，該方法重復(fù)性良好。

2.8穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)取苦碟子注射液（批號(hào)：110601）按2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液6份，室溫放置，分別于放置后0、0.5、1、2、4、6 h取樣，按2.3項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。苯丙氨酸2 h后峰面積的RSD值為5.0%，纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸6 h后峰面積的RSD分別為5.0%、5.5%和6.2%，表明實(shí)驗(yàn)中所需樣品在短時(shí)間內(nèi)能夠保持穩(wěn)定，但仍應(yīng)現(xiàn)用現(xiàn)制。

2.9加樣回收率實(shí)驗(yàn)精密量取已知含量的苦碟子注射液（批號(hào)：110601）0.5mL，平行6份，分別置于10m L量瓶中，分別精密加入含有一定質(zhì)量氨基酸的混合對(duì)照品溶液，其中纈氨酸3.330μg、異亮氨酸1.592μg、亮氨酸1.728μg、苯丙氨酸1.266μg，按2.2項(xiàng)下方法制成供試品溶液，按2.3項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，記錄峰面積，每種氨基酸分別計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見表3。結(jié)果符合方法學(xué)測定要求，表明本方法可準(zhǔn)確測定供試品溶液中的氨基酸含量。

表3　4種氨基酸的加樣回收率Tab.3　Recovery ratesof four am ino acids

2.10含量測定取苦碟子注射液1.00mL，按2.2項(xiàng)下方法制備10批不同批號(hào)的注射液為供試品溶液，按2.3項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，記錄峰面積，計(jì)算4種氨基酸類化合物的含量，結(jié)果見表4。

表4　苦碟子注射液中4種氨基酸的質(zhì)量濃度Tab.4　Contentof four am ino acids in Kudiezi injection mg/L

3　討論與結(jié)論

苦碟子注射液的主要成分為氨基酸類、黃酮類、皂苷類和有機(jī)酸類，然而由于藥材中黃酮類成分含量較大，近期對(duì)苦碟子的研究一般集中于黃酮類成分［8-9］。但是氨基酸水平異常是缺血性腦血管疾病的發(fā)病機(jī)制之一［10］，苦碟子注射液中的氨基酸類成分在其臨床治療心腦血管疾病的過程中具有重要意義。且本實(shí)驗(yàn)中測定的4種氨基酸均為人體必需氨基酸，能夠?yàn)榛颊咛峁I養(yǎng)成分和主要氮源，提高患者的生命質(zhì)量。在建立全面質(zhì)量控制方法時(shí)，對(duì)氨基酸建立可靠的分析方法極其重要。在預(yù)實(shí)驗(yàn)中對(duì)常見的20種氨基酸進(jìn)行了篩查［11-13］，結(jié)果發(fā)現(xiàn)必需氨基酸中纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸在苦碟子注射液中含量較大，故針對(duì)這4種氨基酸進(jìn)行進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化。

在柱前衍生化-高效液相色譜法測定氨基酸含量的過程中，衍生化后的檢測方法通?？蛇x擇熒光法或紫外法［14-15］。熒光檢測器靈敏度高，檢測限低，適用于微量乃至痕量樣品的檢測［7］，但不適用于成分復(fù)雜的中藥注射液。考慮到一機(jī)多用，降低檢測成本，提高方法的重復(fù)性和精確度，本研究選用了紫外法對(duì)苦碟子注射液中的氨基酸含量進(jìn)行了測定，結(jié)果較為理想。在梯度洗脫條件下，流動(dòng)相pH值及比例是保證高效液相色譜法測定氨基酸具有良好重現(xiàn)性的關(guān)鍵環(huán)節(jié)［16］。首先參考文獻(xiàn)［17-19］并結(jié)合本實(shí)驗(yàn)中待分離氨基酸的特征，選擇pH=6.4，分離效果良好。其次由于氨基酸的極性不同，用同一梯度分離多種氨基酸，保留時(shí)間相差很大，導(dǎo)致分析時(shí)間過長，出峰效果不佳。經(jīng)實(shí)驗(yàn)確定了最佳條件，使4種氨基酸和衍生化試劑及其衍生物在較短的時(shí)間內(nèi)被分離。此外，由于衍生化試劑與氨基酸反應(yīng)的產(chǎn)物較不穩(wěn)定［20］，此類衍生化法實(shí)驗(yàn)反應(yīng)時(shí)間均小于2 h。故本實(shí)驗(yàn)中所有樣品均應(yīng)新用新制，及時(shí)進(jìn)行含量測定。

分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果可發(fā)現(xiàn)，不同批次間各氨基酸成分含量差異較大，這可能與原料藥材的引種來源、種植區(qū)域、種植手段、采收季節(jié)等多個(gè)生產(chǎn)環(huán)節(jié)密切相關(guān)，提示應(yīng)進(jìn)一步對(duì)藥材質(zhì)量進(jìn)行控制，以期全面有效地控制注射液質(zhì)量。

采用DNFB柱前衍生高效液相色譜法測定苦碟子注射液中4種氨基酸的含量，具有操作簡便易行、準(zhǔn)確度高、重現(xiàn)性好等優(yōu)點(diǎn)，衍生后剩余的DNFB及其衍生物對(duì)氨基酸的測定無干擾，該方法為苦碟子注射液的質(zhì)量控制方法研究奠定了基礎(chǔ)。

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（本文編輯：高杉，于春泉）

Determ ination of four am ino acids in Kudieziinjection

SUN Lu，LIURui，ZHAOWen，LIYu-bo，ZHANGYan-jun
（Ti anjin University of Traditional Chinese Medicine，Tianjin 300193，China）

［Objective］Toestablish a pre-column deriving determinationmethodwith 2，4-dinitrofluorobenzene（DNFB）for simultaneous quantification of four am ino acids（valine，isoleucine，leucine and phenylalanine）in Kudiezi injection.［M ethods］The determination was performed on a DiamonsilC18（2）column（200mm×4.6mm，5μm）.Themobile phase consisted of ultra purewater，30mmol/LNaAc（containing 1%N，N-dimethylformamide，pH=6.40）and acetonitrile with gradient elution.The flow rate was 1.0m L/min.The column temperaturewassetat25℃and the detectionwavelengthwas350 nm.［Results］Fouraminoacidsof10 batches Kudieziinjectionwere quantified and showed good linear relationship in 0.138 8～4.440，0.124 4～3.980，0.135 0～4.320 and 0.131 9～4.220mg/L，respectively. Themean recoveriesof fouressentialamino acidswere98.49%，100.60%，98.50%and 98.56%，RSD≤2.0%（n=6）.［Conclusion］The method is simp le，accurate，and reliable for quality controlof the Kudiezi injection.

Kudieziinjection；pre-column；2，4-dinitrofluorobenzene；aminoacid；HPLC

R284.2

A

1672-1519（2015）02-0106-04

10.11656/j.issn.1672-1519.2015.02.11

國家“重大新藥創(chuàng)制”科技重大專項(xiàng)（2011ZX09401-305-42）；國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（81303142）；教育部高等學(xué)校博士學(xué)科點(diǎn)專項(xiàng)科研基金項(xiàng)目（2012121012 0001）；天津市應(yīng)用基礎(chǔ)與前沿技術(shù)研究計(jì)劃（14JCQNJC13100）。

孫璐（1990-），女，碩士研究生，主要從事中藥注射液安全性再評(píng)價(jià)及中藥新型給藥系統(tǒng)研究。

劉睿，E-mail:lr_8000@163.com；張艷軍，E-mail: zyjsunye@163.com。

（2014-09-23）