王春鵬，羅　倩，李　晉，何　俊，馬文芳，劉二偉，常艷旭

正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化獨(dú)活總香豆素的滲漉提取工藝*

王春鵬，羅倩，李晉，何俊，馬文芳，劉二偉，常艷旭

（天津市現(xiàn)代中藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津300193）

［目的］研究獨(dú)活總香豆素的最佳滲漉提取工藝。［方法］采用L9（34）正交實(shí)驗(yàn)法，考察乙醇濃度、料液比、浸泡時(shí)間對(duì)獨(dú)活提取物中蛇床子素、二氫山芹醇乙酸酯、二氫山芹醇、二氫山芹醇當(dāng)歸酸酯含量的影響。［結(jié)果］乙醇濃度為影響?yīng)毣羁傁愣顾貪B漉提取效果的主要因素，最佳提取工藝為75%乙醇，料液比為1∶8，浸泡8 h。［結(jié)論］此方法可作為獨(dú)活總香豆素的最佳滲漉提取工藝。

獨(dú)活；滲漉提??；正交實(shí)驗(yàn)；HPLC

獨(dú)活（Radix Angelicae Pubescentis）始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，具有祛風(fēng)除濕、通痹止痛、宣通百脈等功效。獨(dú)活是傘形科植物重齒毛當(dāng)歸（Angelica pubescens Maxim.f.biserrata Shan et Yuan）的干燥根及根莖，現(xiàn)代臨床常用于治療風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、中風(fēng)偏癱、頭痛、慢性氣管炎等病癥［1］。近年來，隨著相關(guān)研究的不斷深入，在獨(dú)活藥理作用［2］和主要成分含量測(cè)定方面［3-5］的研究取得進(jìn)一步發(fā)展。獨(dú)活主要化學(xué)成分為香豆素和揮發(fā)油類，還含有多糖、有機(jī)酸和甾醇等成分［6］。研究證明，獨(dú)活中香豆素為其主要的藥理活性成分［7］。為進(jìn)一步促進(jìn)獨(dú)活香豆素的開發(fā)利用，對(duì)其提取方法的研究是十分必要的。目前常用獨(dú)活香豆素的提取方法以熱回流法［8］和超聲提?。?］報(bào)道最多。熱回流法不僅耗時(shí)過長(zhǎng)，而且有機(jī)溶劑用量多，超聲提取雖然省時(shí)、提取效率高但是其價(jià)格昂貴且不適用于大規(guī)模的生產(chǎn)，而本實(shí)驗(yàn)中滲漉提取法具有操作簡(jiǎn)便、提取率高的優(yōu)點(diǎn)，并且可以避免因加熱和超聲時(shí)間過長(zhǎng)引起的化合物受熱損失。本研究以獨(dú)活香豆素中蛇床子素、二氫山芹醇乙酸酯、二氫山芹醇、二氫山芹醇當(dāng)歸酸酯為評(píng)價(jià)指標(biāo)，通過正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)［10-13］，考察乙醇濃度、料液比、浸泡時(shí)間3個(gè)因素對(duì)提取效果的影響，確定滲漉提取獨(dú)活總香豆素的最佳工藝條件。

1　儀器、試劑與樣品

Waters 2695高效液相色譜儀，包括二元梯度泵，自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱、二極管陣列檢測(cè)器（DAD），Empower色譜工作站。

蛇床子素、二氫山芹醇乙酸酯、二氫山芹醇當(dāng)歸酸酯對(duì)照品均購于成都曼斯特生物科技有限公司，對(duì)照品二氫山芹醇為本課題組從獨(dú)活中分離鑒定，經(jīng)高效液相色譜（HPLC）分析，其含量達(dá)98%以上，乙腈為色譜純，其他試劑均為分析純，實(shí)驗(yàn)用水為超純水。

獨(dú)活藥材為作者購自河北安國(guó)，經(jīng)天津中醫(yī)藥大學(xué)常艷旭副研究員鑒定為獨(dú)活（Radix Angelicae Pubescentis）。粉碎后過4號(hào)篩，備用。

2　方法與結(jié)果

2.1獨(dú)活總香豆素的HPLC測(cè)定

2.1.1色譜分離條件色譜條件參考文獻(xiàn)［5］，色譜柱為Phenomenex Luna C18（4.6mm×250mm，5μm），流動(dòng)相：乙腈（A）-水（B），二元梯度洗脫：0～5min，20%～25%A；5～10 min，25%～30%A；10～15 min，30%～38%A；15～35 min，38%～60%A；35～40 min，60%～80%A；40～50 min，80%A；50～55 min，80%～20%A；55～60min，20%A。檢測(cè)波長(zhǎng)為325nm，進(jìn)樣量為10μL，流速1mL/min，柱溫25℃。

2.1.2標(biāo)準(zhǔn)曲線制備精密稱取蛇床子素、二氫山芹醇乙酸酯、二氫山芹醇、二氫山芹醇當(dāng)歸酸酯對(duì)照品適量，加甲醇溶解，配制成蛇床子素、二氫山芹醇乙酸酯、二氫山芹醇、二氫山芹醇當(dāng)歸酸酯濃度均為2 g/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別移取各標(biāo)準(zhǔn)品溶液適量，加入甲醇稀釋得到濃度各為0.08，0.16，0.24，0.32，0.40，0.80 g/L的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，備用。

2.1.3測(cè)定精密吸取對(duì)照品溶液與供試品溶液各10μL，注入液相色譜儀，測(cè)定，即得。

2.2正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)本次研究主要考察了使用不同乙醇濃度、不同料液比、不同浸泡時(shí)間對(duì)于獨(dú)活總香豆素的影響，各選取3個(gè)水平，以L9（34）正交表安排實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平見表1。

表1　正交實(shí)驗(yàn)因素水平表Tab.1　Factor and level in theorthogonaldesign

3　實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1方法學(xué)考察

3.1.1線性關(guān)系考察按照2.1.1色譜條件分別測(cè)定各混合標(biāo)樣，以對(duì)照品進(jìn)樣濃度（X），各單體香豆素峰面積（），進(jìn)行線性回歸，得線性方程：蛇床子素=57 373X-105，r2=0.999 3；二氫山芹醇乙酸酯= 45 990X+22 958，r2=0.999 4；二氫山芹醇=41 000X+ 16 057，r2=1.000；二氫山芹醇當(dāng)歸酸酯=35 363X+ 17 226，r2=9 995。

3.1.2精密度實(shí)驗(yàn)取同一樣品溶液連續(xù)進(jìn)樣5次，測(cè)定峰面積后計(jì)算RSD分別為蛇床子素2.04%，二氫山芹醇乙酸酯0.67%，二氫山芹醇1.87%，二氫山芹醇當(dāng)歸酸酯2.54%，表明儀器精密度良好。

3.1.3重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)取同一樣品溶液5份平行操作，測(cè)定峰面積后計(jì)算RSD分別為蛇床子素0.56%，二氫山芹醇乙酸酯1.22%，二氫山芹醇1.09%，二氫山芹醇當(dāng)歸酸酯1.94%。說明實(shí)驗(yàn)方法重現(xiàn)性較好。

3.1.4穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)取同一樣品分別于0、2、4、6、8和24h進(jìn)樣，峰面積RSD分別為蛇床子素1.82%，二氫山芹醇乙酸酯1.88%，二氫山芹醇1.53%，二氫山芹醇當(dāng)歸酸酯0.94%。說明樣品在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

3.2滲漉提取方法和供試品溶液處理取獨(dú)活藥材粉末10.0 g，精密稱定，乙醇潤(rùn)濕2 h后裝柱，用以上各條件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，滲濾速度為0.5mL/min，收集滲漉液，濃縮干燥，加入40mL甲醇溶解，搖勻，取1mL溶液過0.45μm有機(jī)濾膜，測(cè)定含量。結(jié)果見表2。

4　討論

本研究對(duì)正交實(shí)驗(yàn)中不同排列組合條件進(jìn)行了綜合比較，結(jié)果顯示A2B3C1的得率最高為4.44%。方差分析表明，影響滲漉提取液中蛇床子素、二氫山芹醇乙酸酯、二氫山芹醇、二氫山芹醇當(dāng)歸酸酯和總香豆素含量因素的大小分別為乙醇濃度＞料液比＞浸泡時(shí)間，其中乙醇濃度（A）為影響蛇床子素、二氫山芹醇、二氫山芹醇當(dāng)歸酸酯和總香豆素含量的主要因素，各水平之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而料液比（B）和浸泡時(shí)間（C）均為次要因素，各水平之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。直觀分析表明，料液比在B2水平下，蛇床子素、二氫山芹醇乙酸酯、二氫山芹醇當(dāng)歸酸酯和總香豆素的含量均最高。在B3水平下，二氫山芹醇含量最高，但B2和B3差異未達(dá)到顯著水平，根據(jù)極差值及節(jié)約溶劑、降低成本的生產(chǎn)實(shí)際，綜合蛇床子素、二氫山芹醇乙酸酯、二氫山芹醇、二氫山芹醇當(dāng)歸酸酯和總香豆素的正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果，確定最佳滲漉工藝為A2B2C1，即75%乙醇，料液比1∶8，浸泡時(shí)間8 h。

香豆素類能溶于水、甲醇、乙醇，而難溶于乙醚、苯等極性小的溶劑［14］。考慮對(duì)總香豆素的溶解與安全等因素，本實(shí)驗(yàn)選擇乙醇作為提取獨(dú)活總香豆素的溶劑。正交實(shí)驗(yàn)表明，75%乙醇滲漉提取的總香豆素含量高于60%乙醇及95%乙醇的提取效果，原因可能是75%乙醇對(duì)總香豆素不僅有較好的溶解性，同時(shí)對(duì)藥材細(xì)胞還有較強(qiáng)的穿透能力。

獨(dú)活總香豆素中含有揮發(fā)性成分，且歐前胡素容易受熱產(chǎn)生成分變化［15］，不宜加熱提取，有關(guān)其他成分穩(wěn)定性的報(bào)道也較少［16］，因此，滲漉法對(duì)于獨(dú)活總香豆素的提取是可取的。該提取方法工藝簡(jiǎn)單，節(jié)約能耗，對(duì)研究香豆素類成分的提取分離具有一定的參考價(jià)值。

表2　正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果及數(shù)據(jù)分析Tab.2　The resu ltsand data analysisof orthogonaldesign

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（本文編輯：高杉，于春泉）

Optim ization orthogonalofpercolation extraction processof Radix Angelicae Pubescentiscoumarin

WANGChun-peng，LUOQian，LIJin，HE Jun，MAWen-fang，LIUEr-wei，CHANGYan-xu
（Tianjin State Key Laboratory ofModern ChineseMedicine，Tianjin University of TraditionalChineseMedicine，Tianjin 300193，China）

［Objective］To investigate the bestpercolation extraction condition of Radix Angelicae Pubescent coumarin.［M ethods］L9（34）orthogonalexperimentalmethod wasused to study the effectsofethanol concentration，solid-liquid ratio，soaking time on the contents of osthole，columbianetin acetate，columbianetin and columbianadin in Radix Angelicae Pubescentextract.［Results］Ethanol concentration was themain factor of affecting percolation，and the optimum extraction was 75%ethanol，solid-liquid ratio of 1∶8，soak 8 hours.［Conclusion］Thismethod could beused as the bestpercolation extraction processof Radix Angelicae Pubescentis coumarin.

Radix Angelicae Pubescentis；percolation；orthogonal test；HPLC

R282.4

A

1672-1519（2015）02-0113-04

10.11656/j.issn.1672-1519.2015.02.13

高等學(xué)校博士學(xué)科點(diǎn)專項(xiàng)科研基金資助項(xiàng)目（201012101 20007）。

王春鵬（1987-）男，碩士研究生，從事中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究。

常艷旭，E-mail:tcmcyx@126.com。

（2014-09-23）