倪天慶，司端運(yùn)，胡思源，魏廣力，夏媛媛

·臨床論著·

DBS法與傳統(tǒng)采樣法用于人體藥物代謝動力學(xué)試驗(yàn)的比較研究*

倪天慶1，司端運(yùn)2，胡思源1，魏廣力2，夏媛媛2

（1.天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，國家藥物臨床試驗(yàn)機(jī)構(gòu)，天津300193；2.天津藥物研究院，釋藥技術(shù)與藥代動力學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津300301）

［目的］探討干血點(diǎn)采樣（DBS）法在熱毒寧注射液藥物代謝動力學(xué)試驗(yàn)中的應(yīng)用，并與傳統(tǒng)的血漿采集方法結(jié)果進(jìn)行比較。［方法］從志愿者肘靜脈取血，一部分進(jìn)行LC-MS/MS定量分析，剩余全血分離血漿，進(jìn)行梔子苷、山梔苷以及京尼平龍膽雙糖苷的血藥濃度分析。色譜柱Ecosil C18（150mm×4.6mm，5μm），流動相甲醇，20mmol/L甲酸銨，0.1%甲酸，10%甲醇，流速0.5mL/min，進(jìn)樣量10μL。質(zhì)譜檢測采用ESI離子源，MRM正離子檢測模式，質(zhì)譜運(yùn)行采集時間11m in。［結(jié)果］單次靜脈滴注熱毒寧注射液，DBS法測定3種梔子成分全血濃度經(jīng)血細(xì)胞比容校正后，梔子苷、山梔苷、京尼平龍膽雙糖苷的達(dá)峰時間（Tmax）分別為1.41、1.47、1.47 h。峰濃度（Cmax）分別為4.580、0.285、0.550μg/mL。濃度-時間曲線下的面積（AUC0-t）分別為9.060、0.638、1.200（μg·h）/m L。平均駐留時間（MRT0-t）分別為1.52、1.49、1.45 h。［結(jié)論］山梔苷、京尼平龍膽雙糖苷血漿法和DBS法（校正后）計(jì)算的血藥濃度和藥代參數(shù)較為一致，表明DBS法在藥物穩(wěn)定性成分的藥物代謝動力學(xué)研究中可替代傳統(tǒng)血漿處理方法。

DBS法；熱毒寧注射液；梔子苷；藥物代謝動力學(xué)；比較研究。

干血點(diǎn)采樣（DBS），是將全血樣品點(diǎn)在特制卡紙上的一種生物樣品采集新技術(shù)，比傳統(tǒng)方法具有很多優(yōu)勢，并可節(jié)省大量研究經(jīng)費(fèi)［1］。DBS法與液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)在藥物定量分析中已成為一個重要方法，但還不夠完善［2-3］。本試驗(yàn)采用DBS法與傳統(tǒng)靜脈血漿采樣法同時取樣，比較分析熱毒寧注射液中梔子類成分，在健康人體內(nèi)的藥時曲線和藥代參數(shù)，從而為DBS法的推廣應(yīng)用提供參考。

1　材料

1．1藥品與試劑熱毒寧注射液：每支10mL，江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)，生產(chǎn)批號130410。梔子苷：含量99.7%，中檢所，批號110749-201115，山梔苷：含量98.36%，中檢所，批號100825，京尼平龍膽雙糖苷：含量98.25%，中檢所，批號100422，桃葉珊瑚苷（內(nèi)標(biāo)）：含量99.5%，中檢所，批號111761-200601。甲醇、乙腈均為色譜純。

1.2儀器美國AB Sciex公司，API 5500型液相色譜-三級四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀，配有電噴霧離子源（ESI）；日本Shimadzu公司液相色譜系統(tǒng)。梅特勒-托利多公司XS-105型分析天平。美國Thermo電子公司17R型冷凍離心機(jī)。美國Zymark公司Turbo Vap LV型樣品濃縮儀。北京踏錦科技有限公司VX-Ⅱ型Targin Tech多管渦旋振蕩器。

2　試驗(yàn)方法

2.1受試者的選擇納入標(biāo)準(zhǔn)［4］：1）健康志愿者，男女各半。2）年齡：18～40歲。3）體重指數(shù)在19～24范圍內(nèi)［體重指數(shù)=體質(zhì)量（kg）/身高2（m2）］，且男性體質(zhì)量60～70 kg、女性體質(zhì)量50～60 kg。4）體格檢查及理化檢驗(yàn)指標(biāo)均在正常范圍。5）志愿簽暑知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：1）3個月內(nèi)用過已知對人體臟器有損害的藥物。2）近1周內(nèi)正在應(yīng)用其他預(yù)防或治療藥物者。3）最近3個月獻(xiàn)血者及試驗(yàn)采血者。4）懷疑或確有酒精、藥物濫用史。5）妊娠期、哺乳期及準(zhǔn)備妊娠婦女。6）法律規(guī)定的殘疾患者。7）根據(jù)研究者判斷，不宜參加試驗(yàn)者。16位健康受試者，經(jīng)全面體檢，血尿便常規(guī)、肝腎功能、心電圖以及血液分析正常，符合試驗(yàn)要求。受試者于試驗(yàn)期間食用統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)餐，試驗(yàn)期間不得飲用碳酸飲料、咖啡、茶葉水等，避免劇烈運(yùn)動。

2.2給藥方法及樣本采集受試者于試驗(yàn)前1 d晚入?、衿谂R床試驗(yàn)病房，禁食過夜10h以上，次日晨起進(jìn)食標(biāo)準(zhǔn)清淡早餐，8∶00時靜脈輸注熱毒寧注射液20mL，以5%葡萄糖注射液稀釋至250mL。使用輸液泵控制恒速滴注90min完畢，滴速為3mL/min。選擇靜脈輸注給藥前，靜脈輸注過程中0.5、1、1.5 h，靜脈輸注停藥后15、30、45min、1、1.25、1.5、2、3、4、6、8、12、24 h從志愿者肘靜脈取血，每次3m L。

2.3血樣及樣品處理志愿者肘靜脈取血3mL至肝素采血管，上下?lián)u勻，吸取40μL全血點(diǎn)卡2份（雙樣本，卡片放于室溫下2 h內(nèi)自然晾干，然后裝入已加有干燥劑的封口袋中于4℃密封保存）。剩余全血以3 000 r/m in離心10 min，分離血漿，吸1份50μL于EP管中，再將剩余的血漿全部轉(zhuǎn)移到另一EP管中，血漿樣品直接凍入-80℃冰箱保存。吸取50μL血漿或空白血漿，50μL甲醇或50μL梔子3種成分系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作液/QC工作液，100μL內(nèi)標(biāo)桃葉珊瑚苷（2μg/m L）甲醇溶液，渦旋1min，4℃12000 r/m in離心10min。取上清液100μL加50μL去離子水，渦旋1min，吸取100μL至內(nèi)插管，進(jìn)樣10μL進(jìn)行LC-MS/MS定量分析。

從全血點(diǎn)卡上，用打孔器打6mm全血紙片至2mLEP管中，加入400μL內(nèi)標(biāo)桃葉珊瑚苷（320ng/mL，甲醇∶水=70∶30配制）溶液，超聲30min，吸取上清液300μL，40℃氮?dú)獯蹈?，?00μL復(fù)溶溶液（甲醇∶水=50∶50）渦旋1 min復(fù)溶，4℃12 000 r/m in離心5min，進(jìn)樣10μL進(jìn)行LC-MS/MS定量分析。

精密稱取梔子苷標(biāo)準(zhǔn)品、山梔苷標(biāo)準(zhǔn)品和京尼平龍膽二糖苷標(biāo)準(zhǔn)品5.00、4.99、5.00mg，分別置于3個5mL的容量瓶中，甲醇定容至刻度，分別獲得1mg/mL的梔子苷、山梔苷、京尼平龍膽二糖苷3種標(biāo)準(zhǔn)品儲備液［6］。用甲醇配制梔子5種待測成分的混合標(biāo)準(zhǔn)貯備液，隨后用甲醇梯度稀釋成濃度為0.01/0.005（梔子苷濃度為0.01μg/mL，山梔苷、京尼平龍膽二糖苷濃度均為0.005μg/mL，以下同此）、0.02/0.01、0.1/0.05、0.5/0.25、2/1、10/5、25/12.5μg/mL的梔子3種成分混合標(biāo)準(zhǔn)系列工作液。精密稱取桃葉珊瑚苷（內(nèi)標(biāo)）標(biāo)準(zhǔn)品4.46mg于10m L的容量瓶中，甲醇定容至刻度，即得桃葉珊瑚苷濃度為446μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)貯備液，并進(jìn)一步用甲醇稀釋為2μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。所有溶液置于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

應(yīng)用LC-MS/MS方法測定人血漿中梔子苷、山梔苷以及京尼平龍膽雙糖苷的含量。人血漿中梔子苷定量分析的線性范圍為0.01～25μg/mL，LLOQ為0.01μg/mL，人血漿中山梔苷和京尼平龍膽雙糖苷定量分析的線性范圍為0.005～12.5μg/m L，LLOQ為0.005μg/mL。在低、中、高3個濃度水平下批內(nèi)精密度（RSD）小于5.38%，批間精密度（RSD）小于8.30%，準(zhǔn)確度（RE）在0.5%～7.4%之間。梔子苷等成分的基質(zhì)效應(yīng)在96.5%～104.0%之間，回收率在94.7%～98.8%之間。

應(yīng)用LC-MS/MS方法測定DBS樣品中梔子苷、山梔苷以及京尼平龍膽雙糖苷的含量。DBS樣品中梔子苷定量分析的線性范圍為0.02～25μg/mL，LLOQ為0.02μg/mL，DBS樣品中山梔苷和京尼平龍膽雙糖苷定量分析的線性范圍為0.01～12.5μg/mL，LLOQ為0.01μg/mL。在低、中、高3個濃度水平下批內(nèi)精密度（RSD）小于5.00%，批間精密度（RSD）小于11.8%，準(zhǔn)確度（RE）在3.0%～12.0%之間。梔子苷等成分的基質(zhì)效應(yīng)在93.5%～104.0%之間，回收率在97.1%～116.0%之間。

2.4測定梔子苷等成分的色譜與質(zhì)譜條件色譜柱：EcosilC18（150mm×4.6mm）。流動相：A甲醇，B 20 mmol/L甲酸銨，0.1%甲酸，10%甲醇。梯度：0min～7min，85%B→60%B；7min～9min，60%B→20%B；9min～11min，20%B→20%B；11min～11.1min，20%B→85%B；11.1 min～15 min，85%B。流速：0.5mL/min，保留時間：桃葉珊瑚苷4.53min，山梔苷5.44min，京尼平龍膽二糖苷8.01min，梔子苷9.68min。卷簾氣：14 psi，碰撞氣：8 psi，噴霧電壓：4 500 V，源溫度：500℃Gas1：80 psi，Gas2：40 psi，入口電壓：10V，碰撞出口電壓：10V，質(zhì)譜運(yùn)行采集時間：11min。

2.5數(shù)據(jù)處理根據(jù)試驗(yàn)中測得的各受試者的血藥濃度-時間數(shù)據(jù)繪制各受試者的藥-時曲線及平均藥-時曲線，進(jìn)行藥物代謝動力學(xué)參數(shù)的估算，求得藥物的主要藥物代謝動力學(xué)參數(shù)［7］，包括：達(dá)峰時間（Tmax，實(shí)測值）、峰濃度（Cmax，實(shí)測值）、平均濃度-時間曲線下的面積（AUC0-t）、藥時曲線下總面積（AUC0-∞）、表觀分布容積（Vd）、半衰期（t1/2）、平均駐留時間（MRT0-t）、總清除率（CL）等，采用WinNonlin 6.3軟件進(jìn)行分析，并對計(jì)量資料進(jìn)行配對t檢驗(yàn)分析。

3　結(jié)果

3.1梔子苷、山梔苷、京尼平龍膽雙糖苷人血漿和DBS法血藥濃度比較見表1。

3.2梔子苷、山梔苷、京尼平龍膽雙糖苷人血漿和DBS法藥代參數(shù)比較見表2。

4　討論

熱毒寧注射液由青篙、金銀花、桅子組成，具有清熱、疏風(fēng)、解毒之功，用于外感風(fēng)熱所致的高熱、微惡風(fēng)寒、頭痛身痛、咳嗽等癥，是治療上呼吸道感染的純中藥注射劑，其中梔子苷與綠原酸做為質(zhì)量檢測指標(biāo)［8］。但其中綠原酸類成分由于在空氣中易于氧化、不穩(wěn)定，無法用于DBS法的含量檢測，故僅選擇梔子苷類成份進(jìn)行比較分析。中藥藥物代謝動力學(xué)研究，較化學(xué)藥物的研究更為困難，一直是研究的熱點(diǎn)和重點(diǎn)問題［9］。液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用，使得分析速度快、選擇性好、簡便、精確、靈敏度高的特點(diǎn)，適用于多組分藥物代謝動力學(xué)研究［10］。

表1　梔子苷、山梔苷、京尼平龍膽雙糖苷人血漿和DBS法血藥濃度的比較（±s）Tab.1　Com parison of theblood drug concentrationsof geniposide，shanzhiside，genipin gentian diglucoside in human plasma and DBS（±s）　μg/mL

表1　梔子苷、山梔苷、京尼平龍膽雙糖苷人血漿和DBS法血藥濃度的比較（±s）Tab.1　Com parison of theblood drug concentrationsof geniposide，shanzhiside，genipin gentian diglucoside in human plasma and DBS（±s）　μg/mL

注：與傳統(tǒng)法比較，*P＜0.05。

時間（h）　　梔子苷　　山梔苷　　京尼平龍膽雙糖苷傳統(tǒng)法　DBS法　　傳統(tǒng)法　DBS法　　傳統(tǒng)法　DBS法0.00 0　0　0　0　0　0 0.50　2.770±0.564　2.740±0.618*　0.140±0.028　0.138±0.033*　0.272±0.059　0.278±0.069* 1.00　3.880±0.642　3.830±0.741*　0.232±0.036　0.226±0.044*　0.444±0.084　0.439±0.086* 1.50　4.420±0.527　4.530±0.747*　0.287±0.034　0.284±0.046*　0.538±0.068　0.544±0.090* 1.75　2.480±0.429　2.630±0.556*　0.219±0.030　0.209±0.039*　0.403±0.069　0.390±0.074* 2.00　1.550±0.367　1.790±0.437*　0.174±0.029　0.169±0.034*　0.310±0.060　0.309±0.064* 2.25　1.080±0.218　1.330±0.314*　0.144±0.022　0.139±0.031*　0.255±0.043　0.253±0.057* 2.50　0.841±0.179　1.110±0.246*　0.123±0.020　0.119±0.024*　0.217±0.038　0.216±0.049* 2.75　0.611±0.129　0.849±0.165*　0.103±0.014　0.097±0.019*　0.182±0.033　0.172±0.037* 3.00　0.496±0.103　0.759±0.145*　0.091±0.014　0.086±0.018*　0.156±0.027　0.155±0.035* 3.50　0.330±0.091　0.578±0.130*　0.070±0.013　0.064±0.014*　0.120±0.025　0.114±0.027* 4.50　0.156±0.048　0.400±0.085*　0.040±0.009　0.036±0.010*　0.069±0.016　0.064±0.017* 5.50　0.083±0.022　0.306±0.063*　0.025±0.006　0.023±0.009　0.042±0.011　0.041±0.013* 7.50　0.027±0.008　0.204±0.047*　0.009±0.004　0.007±0.004*　0.016±0.006　0.013±0.006* 9.50　0.015±0.003　0.162±0.032*　0.004±0.002　0.002±0.002*　0.007±0.003　0.004±0.003*

表2　梔子苷、山梔苷、京尼平龍膽雙糖苷人血漿和DBS法藥代參數(shù)比較（±s）Tab.2　Comparison of the pharmacokinetic parametersof geniposide，shanzhiside，genipin gentian diglucoside in human p lasma and DBS（±s）

表2　梔子苷、山梔苷、京尼平龍膽雙糖苷人血漿和DBS法藥代參數(shù)比較（±s）Tab.2　Comparison of the pharmacokinetic parametersof geniposide，shanzhiside，genipin gentian diglucoside in human p lasma and DBS（±s）

注：與傳統(tǒng)法比較，*P＜0.05。

參數(shù)　　梔子苷　　山梔苷　　京尼平龍膽雙糖苷傳統(tǒng)法　DBS法　　傳統(tǒng)法　DBS法　　傳統(tǒng)法　DBS法t1/2（h）　0 001.420±000.269 0 003.980±000.736*0 0001.420±0 000.172 0 0001.130±0 000.195*0 0001.470±0 000.148 0 0001.200±0 000.221* Tmax（h）　0 001.410±000.202 0 001.410±000.202　0 0001.470±0 000.125 0 0001.470±0 000.125　0 0001.470±0 000.125 0 0001.470±0 000.125 Cmax（ng/mL）　0 004.490±000.438 0 004.580±000.644　0 0000.288±0 000.033 0 0000.285±0 000.044　0 0000.541±0 000.065 0 0000.550±0 000.084 AUC0-t［（μg·h）/mL］0 007.410±001.000 0 009.060±001.570*0 0000.671±0 000.090 0 0000.638±0 000.121*0 0001.220±0 000.190 0 0001.200±0 000.230 AUC0-∞［（μg·h）/mL］0 007.440±001.010 0 010.000±001.760*0 0000.679±0 000.093 0 0000.642±0 000.122　0 0001.240±0 000.193 0 0001.210±0 000.230 Vd（L）　0 005.632±001.477 0 011.711±002.605*0 0060.912±0 008.893 0 0051.916±0 008.663*0 0035.169±0 007.276 0 0029.275±0 005.823* CL（L/h）　2 736.000±372.000 2 061.000±386.000*29 950.000±3 992.000 32 259.000±6 333.000*16 575.000±2 720.000 17 228.000±3 504.000* MRT0-t（h）　0 000.856±000.072 0 001.520±000.107*00 001.589±0 000.149 00 001.490±0 000.173*0 0001.520±0 000.137 0 0001.450±0 000.143* MRT0-∞（h）　0 000.897±000.077 0 002.750±000.427*00 001.697±0 000.200 00 001.540±0 000.212*00 001.640±0 000.175 0 0001.510±0 000.189*

健康受試者單次靜脈滴注熱毒寧注射液，DBS法測定3種梔子成分的全血濃度經(jīng)血細(xì)胞比容校正后，梔子苷、山梔苷、京尼平龍膽雙糖苷的Tmax分別為1.41、1.47、1.47 h；Cmax別為4.58、0.285、0.550μg/mL；AUC0-t分別為9.06、0.638、1.20（μg·h）/mL；MRT0-t分別為1.52、1.49、1.45h；CL分別為2.06、32.3、17.2L/h；Vd分別為11.7、51.9、29.3 L；t1/2分別為3.98、1.13、1.20 h。與文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)的動物試驗(yàn)結(jié)果有差異［11-14］。

山梔苷、京尼平龍膽雙糖苷血漿法和DBS法（校正后）計(jì)算的血藥濃度和藥代參數(shù)較為一致，而梔子苷的血藥濃度數(shù)據(jù)從給藥結(jié)束后1 h起開始出現(xiàn)差異，從3.1可以看出，DBS法測定的血藥濃度要高于血漿法的測定結(jié)果，從藥時曲線上看，DBS梔子苷的消除下降趨勢變緩，因此導(dǎo)致t1/2、AUC0-t、MRT0-t均明顯高于血漿法的計(jì)算結(jié)果，產(chǎn)生這一結(jié)果的原因還需要進(jìn)一步的研究。

圖1　梔子苷、山梔苷、京尼平龍膽雙糖苷人血漿和DBS法藥時曲線比較Fig.1　Com parison of the concentration tim e curve of geniposide，shanzhiside，genipin gentian diglucoside in human p lasma and DBS

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（本文編輯：馬曉輝，高杉）

DBSmethodw ith traditionalsamp lingmethod for com parative study ofhuman pharmacokinetics test

NITian-qing1，SIDuan-yun2，HU Si-yuan1，WEIGuang-li2，XIA Yuan-yuan2
（1.ClinicalResearch InstituteOffice，The FirstAffiliated HospitalofTianjin University ofTraditionalChineseMedicine，Tianjin 300193，China；2.State Key Laboratory of Drug Delivery Technologyand Pharmacokinetics，Tianjin Institute of Pharmaceutical Research，Tianjin 300301，China）

［Objective］App lication of DBSmethod in Reduning injection pharmacokinetics test，and comparison of plasma collection results of traditionalmethods.［M ethods］Theelbow vein blood taken from the volunteers，some blood was quantitativeanalysisby LCMS/MS quantitative analysis.We separated of the remaining blood plasma，analysis of blood drug concentration of geniposide and genipin，shanzhisidegentian diglucoside.Chromatographic column EcosilC18（150mm×4.6mm，5μm），themobilephasemethanol，20mM ammonium formate，0.1%formic acid，10%methanol，Velocity 0.5mL/min，sample size 10μL.Mass spectrometric detection using ESI ion source，the MRM positive ion detectionmode，acquisition time of 11 min.［Results］A single intravenous infusion of Reduning injection，the blood concentration of blood cell volume determination of three kinds of gardenia componentwith DBSafter correction，geniposide，shanzhiside，genipin gentian diglucoside in peak time（Tmax）were1.41，1.47，1.47 h.The peak concentration（Cmax）were4.580，0.285，0.550μg/mL.Thearea under the concentration time curve（AUC0-t）were9.060，0.638，1.200（μg·h）/mL.The average dwell time（MRT0-t）were 1.52，1.49，1.45 h.［Conclusion］It is consistent of blood drug concentration and pharmacokinetic parameters about the shanzhiside，genipin gentian diglucoside plasmamethod and DBSmethod（after correction）.It indicates thatDBSmethod can replace the traditional plasma processingmethod in pharmacokinetic studiesof drug stability ingredient.

DBS；Reduning injection；geniposide；pharmacokinetics；comparative study

R969.1

A

1672-1519（2015）02-0068-04

10.11656/j.issn.1672-1519.2015.02.02

“十二五”重大新藥創(chuàng)制項(xiàng)目（2011ZX09302-006-03）。

倪天慶（1978-），男，副主任藥師，研究方向?yàn)橹兴幮滤幍难芯颗c評價(jià)。

胡思源，E-mail:HSY008@163.com。

（2014-10-23）