李銀玲, 肖明明, 表貞淑, 侯 慧, 楊 锎, 祝立麗, 景士兵

實驗研究

STAT3和VEGF在皮膚惡性黑色素瘤組織中的表達及臨床意義

李銀玲, 肖明明, 表貞淑, 侯 慧, 楊 锎, 祝立麗, 景士兵

目的 探討信號傳導與轉錄激活因子3和血管內皮生長因子在皮膚惡性黑色素瘤中的表達及臨床意義。方法 采用組織芯片免疫組化學S- P法、免疫印跡法檢測信號傳導與轉錄激活因子3及血管內皮生長因子在35例皮膚惡性黑色素瘤、30例色素痣組織中的表達情況。結果 在皮膚惡性黑色素瘤組織中,信號傳導與轉錄激活因子3、血管內皮生長因子的表達陽性率分別為65.7%、60.0%，均明顯高于在色素痣中表達的陽性率(P<0.01)。皮膚惡性黑色素瘤中信號傳導與轉錄激活因子3和血管內皮生長因子表達均與腫瘤的細胞生長、浸潤深度和淋巴結轉移呈正相關(P<0.05)；信號傳導與轉錄激活因子3和血管內皮生長因子的表達呈顯著正相關(P<0.001)。結論 信號傳導與轉錄激活因子3可能通過上調血管內皮生長因子的表達，促進皮膚惡性黑色素瘤組織中新生血管的形成，與腫瘤生長、侵襲和轉移呈密切相關。為皮膚惡性黑色素瘤的靶向性治療提供新思路。

皮膚惡性黑色素瘤; 信號傳導與轉錄激活因子3; 血管內皮生長因子; 免疫組化學

皮膚惡性黑色素瘤(cutaneous malignant melanoma, CMM)是一種起源于外胚葉神經(jīng)嵴黑素細胞的高度惡性的腫瘤。易早期發(fā)生侵襲和轉移，預后差，死亡率高，嚴重影響人類的健康和生存質量。本實驗主要通過免疫組化法檢測CMM組織中信號傳導與轉錄激活因子3(signal transducers and transcription activators 3， STAT3)和血管內皮生長因子(vascular endothelail growth factor， VEGF)蛋白的表達情況，探討其與臨床病理特征的關系及二者之間表達的關系。

1 臨床資料

選用我院病理科2005年1月至2014年6月活檢標本存檔蠟塊。CMM 35例，男性19例，女性16例，平均年齡(52.50±8.57)歲；色素痣30例，男性15例，女性15例，平均年齡(48.35±9.86)歲。CMM根據(jù)Clerk分級:Ⅰ級2例、Ⅱ級5例、Ⅲ級13例、Ⅳ級9例、Ⅴ級6例；根據(jù)有無轉移分3期:Ⅰ期(無轉移)21例、Ⅱ期(伴局部淋巴結轉移)9例、Ⅲ期(伴遠處器官轉移)5例。色素痣為對照組, 其中皮內痣15例、復合痣8例、交界痣7例。所有標本均為手術切除獲得,術前未經(jīng)放療、化療和其他免疫治療,患者均知情同意。

2 實驗方法

2.1 試劑 STAT3多抗,VEGF多抗,SABC試劑盒及顯色劑均購自北京中杉金橋生物技術有限公司。2.2 構建組織芯片 組織芯片整齊排列，制成蠟塊，連續(xù)切片常規(guī)作HE染色，切片厚度為5 μm，裱片溫度控制在40 ℃左右，余同常規(guī)制片，用于免疫組織化學染色的組織片裱于經(jīng)10%APES的丙酮液處理的載玻片上，用紫外線燈烤片以防止掉片或移位。2.3 免疫組織化學染色 組織芯片常規(guī)脫蠟，切片浸于50 mmol/L EDTA溶液中(pH 8.0)，微波抗原修復10 min，冷卻至室溫，充分水洗，PBS浸洗，滴加正常山羊血清封閉液，室溫封閉20 min，甩去多余液體，不洗，加入VEGF單抗或STAT3單抗4 ℃過夜；PBS洗滌；滴加SP 9000通用型生物素標記二抗，37 ℃孵育20 min，PBS液沖洗2 min，3次；顯色劑顯色；自來水充分沖洗，復染，脫水透明，封片。由正常小鼠血清代替一抗作替代對照，PBS作空白對照。2.4 蛋白質提取與Western blot鑒定 收集新鮮組織在離心管中，使用NP40裂解液冰上勻漿組織。13 000 g 4 ℃離心30 min，將上清轉到新的離心管中，取上清5 μl，選用G250考馬斯亮藍方法進行蛋白定量。將蛋白定量后，取40 μg總蛋白經(jīng)10% SDS- PAGE凝膠分離，4 ℃過夜40 V恒壓轉移到PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉1 h。根據(jù)目標蛋白的分子量，切割PVDF膜，用一抗室溫孵育2 h，TBST洗膜3次，每次10 min。再用辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠(1∶5000稀釋)二抗孵育2 h，TBST洗膜3次，每次10 min。ECL顯影，Image Lab圖像分析軟件測定灰度值，以GAPDH為內參照記錄各目的蛋白的相對灰度值。2.5 結果判斷 STAT3以腫瘤細胞的胞漿和(或)細胞核中出現(xiàn)棕黃色顆粒為染色陽性，VEGF以腫瘤細胞的胞質中出現(xiàn)棕黃色顆粒為染色陽性。高倍鏡下隨機選取5個視野進行計數(shù)，著色細胞<5%為陰性(-)，5%～25%為弱陽性(+)，26%～50%為陽性()，>50%為強陽性()。2.6 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 10.0軟件進行統(tǒng)計分析，計數(shù)資料采用χ2檢驗，P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。兩因素間的相關性采用Spearman等級相關檢驗分析。

3 結果

STAT3和VEGF在CMM中的陽性率為65.7%和60.0%,在色素痣中的陽性率為16.7%和3.3%,二者差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。STAT3在CMM組織中主要在腫瘤細胞胞漿內表達(圖1) ，在色素痣組織中大部分無表達(圖2) ；VEGF在CMM組織中主要在腫瘤細胞胞質內表達(圖3)，在色素痣組織中基本無表達(圖4)。免疫印跡法(westernblot，WB)檢測正常皮膚、色素痣、CMM各5例，STAT3和VEGF蛋白在CMM中的表達明顯強于皮內痣及正常皮膚(圖5)。CMM組織中STAT3及VEGF表達與Clark分級和有無淋巴結轉移密切相關(P<0.05，表1)，二者的表達差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.001，表2)。

4 討論

信號轉導和轉錄活化因子(STATs) 家族包括7個成員：STAT1～4、STAT5a、STAT5b 和STAT6b，STAT3最易發(fā)生結構磷酸化和誘導腫瘤發(fā)生[1]。在生理狀態(tài)下，正常細胞中STAT3 的激活短暫，但在惡性腫瘤細胞中STAT3 被持續(xù)激活，并促進腫瘤的增殖、侵襲和轉移[2]。研究證實，在多種人類腫瘤細胞中，STAT3蛋白高表達可上調與腫瘤細胞增殖、凋亡、侵襲和轉移相關的靶基因表達，如細胞周期基因的原癌基因(c- myc、pim- 1)、細胞周期蛋白(cyclin)、細胞凋亡抑制因子Bcl家族、熱休克蛋白、VEGF等，所以STAT3蛋白可能是參與誘發(fā)腫瘤的關鍵蛋白。

VEGF 是目前已知最重要的促血管生成因子之一， 其廣泛表達于成纖維細胞、平滑肌細胞、內皮細胞及腫瘤細胞等多種細胞，但其受體(flt- 1、flk- 1)則僅表達于血管內皮細胞,因此是一個特異作用于血管內皮細胞的因子，并具有多種生物學功能： ⑴選擇性增強血管內皮細胞有絲分裂,刺激內皮細胞增殖和血管形成[3]；⑵增強微小血管的滲透性,使血漿大分子外滲沉積在血管外的基質中,為腫瘤細胞的生長和新生毛細血管網(wǎng)的建立提供營養(yǎng)；⑶抑制抗原呈遞細胞的成熟，逃避免疫應答[4]。VEGF與腫瘤的發(fā)生和轉移密切相關，能直接反映腫瘤細胞的生長速度和轉移傾向，可作為腫瘤代謝及轉移的標志。二者在CMM中表達較色素痣組強, 可推測在CMM中STAT3和VEGF有促進微血管生成的作用。因腫瘤的預后與組織類型、分級、淋巴結轉移等多種情況有關。研究中STAT3和VEGF在Clark分級高的和有淋巴結轉移組的陽性表達率顯著高于Clark分級低的和無淋巴結轉移組，說明它們與CMM細胞生長、局部侵襲和淋巴結轉移密切相關。有學者認為，STAT3和VEGF在體內外協(xié)同刺激內皮細胞的增生和毛細血管的生成。Wang等[5]研究證明，利用RNA干預技術沉默STAT3可以降低VEGF的表達。Cheong等[6]報道，異澤蘭黃素可以通過阻斷胃癌MKN- 45細胞的STAT3通路而抑制VEGF表達。本研究也表明,在CMM組織中STAT3和VEGF共陽性表達與共陰性表達差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。說明STAT3與VEGF呈正相關，推測STAT3和VEGF在促進血管形成方面有協(xié)同作用。可能與STAT3調控VEGF及其受體的表達，誘導VEGF的合成有關。同時提示了CMM在控制新血管生成治療方法中應多因素聯(lián)合應用。

圖1 STAT3在CMM中陽性表達(SP ×400) 圖2 STAT3在色素痣中陰性表達(SP ×100) 圖3 VEGF在CMM中陽性表達(SP ×400) 圖4 VEGF在色素痣中陰性表達(SP ×100) 圖5 WB法檢測STAT3、VEGF在正常皮膚組織(1)、色素痣(2)及CMM(3)中蛋白表達情況

Fig 1 The positive expression of STAT3 protein in CMM (SP ×400). Fig 2 The negative expression of STAT3 protein in nevus (SP ×100). Fig 3 The positive expression of VEGF protein in CMM (SP ×400). Fig 4 The negative expression of VEGF protein in nevus (SP ×100). Fig 5 The expression of STAT3, VEGF protein in normal skin tissue(1), nevus(2) and CMM(3) by WB.

表1 STAT3、VEGF蛋白表達與CMM臨床病理特征的關系

Tab 1 Relationship between the expression of STAT3 and VEGF and clinical pathological characteristics of CMM

因素Clark分級(例,%)Ⅰ級Ⅱ級Ⅲ級Ⅳ級Ⅴ級淋巴結轉移(例,%)Ⅰ期Ⅱ期Ⅲ期STAT302(40.0)8(61.5)7(77.8)6(100.0)10(47.6)8(88.9)5(100.0)VEGF1(50.0)2(40.0)6(46.2)6(66.7)6(100.0)9(42.9)7(77.8)5(100.0)

表2 STAT3和VEGF在CMM中的表達相關性

STAT3、VEGF可能在CMM發(fā)生、發(fā)展、浸潤及轉移等方面都發(fā)揮著重要作用。其對判斷CMM的淋巴結轉移，抗血管治療和預后具有臨床應用價值，可以作為CMM臨床輔助診斷，也可用于評價抗血管生成藥物的治療效果。

[1] 王梅平, 陳燕凌, 黃 焱, 等. 白細胞介素6促膽囊癌細胞增殖、侵襲與JAK/STAT3信號通路的關系[J]. 中國普通外科雜志, 2013,22(8):982- 987.

[2] 葉立群, 張謝夫, 趙春臨, 等. 結直腸癌組織STAT3和MMP- 9表達及其與血管生成相關性的研究[J]. 中華腫瘤防治雜志, 2011,18(12):949- 952.

[3] 哈建利, 張澤波. 卵巢癌組織中VEGF的表達及其與MVD的關系[J]. 咸寧學院學報:醫(yī)學版, 2011,25(4):296- 298.

[4] 楊憲廣, 孫 冀.VEGF研究進展及其在喉癌中的相關研究實用腫瘤學雜志[J]. 實用腫瘤學雜志, 2011,25(6):575- 578.

[5]WangXH,LiuBR,QuB,etal.SilencingSTAT3mayinhibitcellgrowththroughregulatingsignalingpathway,telomerase,cellcycle,apoptosisandangiogenesisinhepatocellularcareinoma：potentialusesforgenetherapy[J].Neoplasma, 2011,58(2):158- 171.

[6]CheongJH,HongSY,ZhengY,etal.EupatilininhibitsgastriccancercellgrowthbyblockingSTAT3-mediatedVEGFexpression[J].JGastricCancer, 2011,11(1):16- 22．

Expression of signal transducers and transcription activators 3 and vascular endothelial growth factor in cutaneous malignant melanoma and its clinical significance

LIYin-ling,XIAOMing-ming,BIAOZhen-shu,etal.

(DepartmentofDermatology,People′sHospitalofLiaoningProvince,Shenyang110016,China)

Objective To explore the expression of signal transducers- transcription activators 3 and vascular endothelial growth factor in cutaneous malignant melanoma and its clinical significance. Methods The expression of signal transducers- transcription activators 3 and vascular endothelial growth factor were examined in 35 cases of cutaneous malignant melanoma and 30 cases of nevus by immunohistochemistry and Western blot. Results The positive rates of signal transducers- transcription activators 3 and were 65.7% and 60.0% in the cutaneous malignant melanoma, which were significantly higher than those which were 15.4% and 3.3% in the nevus (P<0.01).Boththeexpressionofsignaltransducers-transcriptionactivators3andvascularendothelialgrowthfactorweresignificantlycorrelatedtogrowthoftumorcell,depthoftumorinvasionandtumorlymphnodemetastasis(P<0.05).Moreover,asignificantcorrelationwasfoundbetweentheexpressionofsignaltransducers-transcriptionactivators3andvascularendothelialgrowthfactorincutaneousmalignantmelanoma(P<0.001). Conclusion The signal transducers- transcription activators 3 may promote the formation of new blood vessels in the CMM by up- regulating the expression of vascular endothelial growth factor which was closely correlated to the tumor growth, invasion and metastasis．This study will provide new way for the targeted treatment of cutaneous malignant melanoma.

Cutaneous malignant melanoma; Signal transducers and transcription activators 3; Vascular endothelial growth factor; Immunohistochemistry

110016 遼寧 沈陽，遼寧省人民醫(yī)院 (皮膚科:李銀玲, 表貞淑, 楊 锎, 祝立麗;病理科:肖明明, 侯 慧, 景士兵)

李銀玲(1978- )，女，遼寧沈陽人，主治醫(yī)師，碩士研究生. 通信作者：景士兵，110016，遼寧省人民醫(yī)院 病理科，電子信箱：mypathology@163.com

10.3969/j.issn.1673- 7040.2015.03.023

R

A

1673- 7040(2015)03- 0190- 03

2014- 12- 19)