于冬梅, 丁 爽, 尚 勇, 羅 賽, 徐海倩, 郝立君

瘢痕研究

瘢痕疙瘩中人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶和caspase- 3基因的表達(dá)及意義

于冬梅, 丁 爽, 尚 勇, 羅 賽, 徐海倩, 郝立君

目的 研究瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞中人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶和caspase- 3的表達(dá)及二者間的關(guān)系，以及兩種因子與瘢痕疙瘩發(fā)生、發(fā)展機(jī)制的關(guān)系。方法 以普通瘢痕為對(duì)照，采用RT- PCR和蛋白免疫印染法，研究瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞中，人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶、caspase- 3 mRNA和蛋白表達(dá)的變化，并進(jìn)行比較分析。結(jié)果 瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞中，人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶的mRNA和蛋白表達(dá)水平高于普通瘢痕(P<0.01)；而活化caspase- 3的表達(dá)水平活性顯著低于普通瘢痕(P<0.05)。結(jié)論 人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶和caspase- 3在瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞中的表達(dá)存在異常，它們對(duì)瘢痕疙瘩形成過(guò)程中的成纖維細(xì)胞異常增殖和凋亡起著重要的作用。

瘢痕疙瘩； 人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶；caspase- 3

瘢痕疙瘩是皮膚損傷后組織病理性修復(fù)的結(jié)果。研究表明，瘢痕疙瘩中成纖維細(xì)胞的增殖- 凋亡調(diào)控的失衡是導(dǎo)致瘢痕疙瘩不斷增生,難以退化的細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)[1- 3]。端粒酶是一種逆轉(zhuǎn)錄酶，其活性與細(xì)胞的無(wú)限增殖存在密切的關(guān)系。人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(human telomerase reverse transcriptase, hTERT)是端粒酶組成成分之一，且hTERT的表達(dá)與端粒酶的活性呈平行關(guān)系[4]。Caspas- 3的活化被認(rèn)為是細(xì)胞凋亡進(jìn)入不可逆階段的標(biāo)志[5]。因此，研究?jī)烧咴隈：鄹泶裰械谋磉_(dá)，將為探討瘢痕疙瘩的發(fā)生機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 對(duì)象與方法

1.1 對(duì)象來(lái)源 選擇2012年5月至2014年5月在我院行手術(shù)治療的60例患者。瘢痕疙瘩組30例。男性4例，女性26例；平均年齡32歲。部位分布：胸部15例，肩部3例，耳垂部12例。無(wú)明顯創(chuàng)傷史，具有家族史；普通瘢痕組30例。男性17例，女性13例；平均年齡35歲。為3年以上的扁平瘢痕。兩組均經(jīng)臨床及病理確診?；颊呔炇鹬橥鈺?shū)。

1.2 試劑 TRIzol試劑盒購(gòu)自美國(guó)INVITROGEN公司；逆轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)試劑盒、TaqDNA聚合酶購(gòu)自美國(guó)PROMEGA公司；引物由上海生物工程技術(shù)有限公司合成；鼠抗人hTERT單克隆抗體、兔抗人caspas- 3單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)SANTA CRUZ公司。1.3 RT- PCR測(cè)定目的基因mRNA表達(dá) 將手術(shù)切除的瘢痕組織，分別用TRIzol提取總RNA，所得樣品經(jīng)凝膠電泳驗(yàn)證后，將合格樣品迅速參照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。擴(kuò)增目的基因引物序列(表1)，反應(yīng)條件為94 ℃ 40 s，57 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，共32個(gè)循環(huán)。以B- actin內(nèi)參照，檢測(cè)轉(zhuǎn)錄效率。PCR產(chǎn)物用2.0%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成象系統(tǒng)觀察拍照。1.4 Western blot測(cè)定目的基因蛋白表達(dá) 將手術(shù)切除的瘢痕組織制成組織勻漿，分別提取總蛋白，100 ℃煮沸變性5 min，樣品通過(guò)12%SDS- PAGE分離后轉(zhuǎn)至PVDF膜上，加入一抗，4 ℃過(guò)夜，用TBST洗膜10 min，3次，加入11∶20稀釋的生物素化二抗工作液，室溫振搖1 h，TBST洗膜后，加入11∶20稀釋的辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液，室溫振搖1 h，TBST洗膜10 min，3次，用DAB室溫避光顯色，至理想條帶出現(xiàn)，水沖洗，膜保存于PBS中照相。最后以圖像分析系統(tǒng)測(cè)定各條帶灰度值，以β- tubulin作為內(nèi)參照，以此反映目的蛋白的表達(dá)程度。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 各組結(jié)果采用組間比較t檢驗(yàn)，運(yùn)用SPSS13.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 RT- PCR檢測(cè)目的基因mRNA的表達(dá) RT- PCR反應(yīng)條件優(yōu)化確定后，以普通瘢痕組為對(duì)照，以B- actin作為內(nèi)參照，將瘢痕疙瘩組織總RNA逆轉(zhuǎn)錄的cDNA模板調(diào)整相對(duì)一致，然后以調(diào)整的模板擴(kuò)增目的基因(圖1，2)。在RNA模板量、實(shí)驗(yàn)條件、反應(yīng)條件一致的情況下，特異電泳條帶經(jīng)計(jì)算機(jī)灰度掃描定量后，計(jì)算各組比值。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞目的基因hTERTmRNA的含量與普通瘢痕組比較，P<0.01為差異具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而兩者的caspase- 3電泳條帶亮度無(wú)明顯差異。2.2Westernblot測(cè)定目的基因蛋白表達(dá) 各組結(jié)果顯示，內(nèi)參照B-tublin(51kD)雜交帶亮度相似，在位于120kD蛋白條帶位置均呈現(xiàn)hTERT特異性蛋自雜交帶的表達(dá)，但亮度有明顯差異，瘢痕疙瘩組的蛋自條帶亮度明顯高于普通瘢痕組(P<0.05)，而caspase- 3蛋白的分子量為32kD，活化時(shí)降解成分子量為17kD和12kD兩個(gè)亞單位，但免疫印染分析往往只能檢測(cè)到17kD的亞單位，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)瘢痕疙瘩組僅32kD的caspase- 3特異蛋白條帶亮度明顯高于普通瘢痕，而17kD亞單位條帶亮度在普通瘢痕組中明顯增高，表明caspase- 3活性被激活(P<0.05，圖3)。

3 討論

瘢痕疙瘩因其具有持續(xù)性生長(zhǎng)、無(wú)自限性及切除后易復(fù)發(fā)的臨床特點(diǎn)，被很多學(xué)者視為一種腫瘤而進(jìn)行研究。瘢痕組織內(nèi)最主要的功能細(xì)胞----成纖維細(xì)胞的異常高、增殖低和凋亡的特征性生物學(xué)行為被認(rèn)為是瘢痕形成過(guò)程的重要因素[6- 9]。

端粒是位于真核細(xì)胞染色體末端的核酸- 蛋白復(fù)合體，具有維持染色體結(jié)構(gòu)和功能的完整性及穩(wěn)定性的作用，與細(xì)胞的增殖及凋亡密切相關(guān)。端粒酶是維持端粒穩(wěn)定的重要因素，hTERT是端粒酶活性的限速?zèng)Q定因子[10- 12]。研究結(jié)果顯示，瘢痕疙瘩組織中hTERT的表達(dá)明顯高于普通瘢痕，兩組比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明hTETR表達(dá)上調(diào)與瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞的異常增殖密切相關(guān)。

表1 引物序列和片段長(zhǎng)度

圖1 hTERT和β- actinPCR產(chǎn)物電泳結(jié)果(M:marker;1～3:瘢痕疙瘩;4～6:普通瘢痕) 圖2 caspase- 3和β- actinPCR產(chǎn)物電泳結(jié)果(M:marker;1～3:瘢痕疙瘩;4～6:普通瘢痕) 圖3 hTERT、caspase- 3和β- tubulin Western blot結(jié)果(1～3:瘢痕疙瘩;4～6:普通瘢痕)

Fig 1 PCR products of hTERT and β- actin (M:marker; 1～3:keloid; 4～6:scars). Fig 2 PCR products of caspase- 3 and β- actin (M:marker; 1～3:keloid; 4～6:scars). Fig 3 Westem blot results of hTERT, caspase- 3 and β- actin (1～3:keloid; 4～6:scars).

同時(shí)，caspase- 3是細(xì)胞凋亡的核心機(jī)制，通過(guò)級(jí)聯(lián)式激活而發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)，一旦激活，便“開(kāi)啟”凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)，使細(xì)胞發(fā)生不可逆的凋亡進(jìn)程[13- 15]。研究表明，瘢痕疙瘩和普通瘢痕組織中，caspase- 3 mRNA的表達(dá)無(wú)顯著差異，而在蛋白水平，普通瘢痕組織中存在被激活的caspase- 3，兩組比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，caspase- 3的激活障礙與瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞的異常凋亡密切相關(guān)。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)探討瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞增殖、凋亡的關(guān)鍵因子，對(duì)瘢痕疙瘩形成機(jī)制進(jìn)行探究，但如何準(zhǔn)確調(diào)控hTERT、激活caspase- 3以及如何控制信號(hào)傳導(dǎo)使細(xì)胞向凋亡方向進(jìn)行將是下一步的研究重點(diǎn)。

[1] Suarez E, Syed F, Rasgado TA, et al. Skin equivalent tensional force alters keloid fibroblast behavior and phenotype[J]. Wound Repair Regen, 2014,22(5):557- 568.

[2] 刁建升, 馬顯杰. 瘢痕疙瘩發(fā)病機(jī)制和藥物治療研究新進(jìn)展[J]. 中國(guó)美容整形外科雜志, 2013,24(3):187- 189.

[3] Yu D, Shang Y, Luo S, et al. The TaqI gene polymorphisms of VDR and the circulating 1,25- dihydroxyvitamin D levels confer the risk for the keloid scarring in Chinese cohorts[J]. Cell Physiol and Biochem, 2013,32(1):39- 45.

[4] Daniel M, Peek GW, Tollefsbol TO. Regulation of the human catalytic subunit of telomerase (hTERT)[J]. Gene, 2012,498(2):135- 146.

[5] Snigdha S, Smith ED, Prieto GA, et al. Caspase- 3 activation as a bifurcation point between plasticity and cell death[J]. Neurosci Bull, 2012,28(1):14- 24.

[6] 郭 亮, 徐 凱, 章 鑫, 等. PTEN,Akt,TGF- β1蛋白在瘢痕疙瘩中的表達(dá)[J]. 中國(guó)美容整形外科雜志, 2013,24(8):505- 507.

[7] Viera MH, Vivas AC, Berman B. Update on keloid management: clinical and basic science advances[J]. Adv Wound Care (New Rochelle), 2012,1(5):200- 206.

[8] Ledon JA, Savas J, Franca K, et al. Intralesional treatment for keloids and hypertrophic scars: a review[J]. Dermatol Surg, 2013,39(12):1745- 1757.

[9] Liu XD, Fan RF, Zhang Y, et al. Down- regulation of telomerase activity and activation of caspase- 3 are responsible for Tanshinone I- induced apoptosis in monocyte leukemia cells in vitro[J]. Int J Mol Sci, 2010,11(6):2267- 2280.

[10] 牛海鑫. 瘢痕細(xì)胞凋亡死亡受體傳導(dǎo)途徑的研究進(jìn)展[J]. 中國(guó)美容整形外科雜志, 2012,23(2):119- 121.

[11] Lü MH, Liao ZL, Zhao XY, et al. hTERT- based therapy: a universal anticancer approach (Review)[J]. Oncol Rep, 2012,28(6):1945- 1952.

[12] 于冬梅, 尚 勇, 王永儉, 等. RNA干擾Survivin基因表達(dá)對(duì)瘢痕疙瘩中成纖維細(xì)胞增殖與凋亡的影響[J]. 中國(guó)美容整形外科雜志, 2009,20(10):603- 607.

[13] 陳煜華, 魯開(kāi)化, 刁建升, 等. 靶向沉默血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子對(duì)兔耳增生性瘢痕的影響[J]. 中國(guó)美容整形外科雜志, 2013,24(3):144- 147.

[14] Pastuszak- Gabinowska M, Peregud- Pogorzelski J,uksza K, et al. Some aspects of molecular bases of keloid formation[J]. Ann Acad Med Stetin, 2011,57(2):10- 17.

[15] 于冬梅, 郝立君, 肖志波, 等. survivin和caspase- 3在病理性瘢痕成纖維細(xì)胞中的表達(dá)及其意義[J]. 中國(guó)美容整形外科雜志, 2008,19(1):77- 80.

Expressions of human telomerase reverse transcriptase and caspase- 3 in keloid and its significance

YUDong-mei,DINGShuang,SHANGYong,etal.

(PlasticandCosmeticCenter,TheFirstAffiliatedHospitalofHarbinMedicalUniversity,Harbin150001,China)

Objective To study the expression and relationships of human telomerase reverse transcriptase and caspas- 3 gene in keloid derived fibroblasts and the relationships between the expression of two genes and the occurrence & development mechanism of the keloid. Methods The normal scar as the control group, the changes of human telomerase reverse transcriptase and caspase- 3 expression were detected by semi- quantitative RT- PCR and Western blot methods, then the results were analyzed. Results Compared with scar, The expression of mRNA and protein of human telomerase reverse transcriptase was higher in fibroblasts of keloid (P<0.01),buttheexpressionofactivatedcaspase- 3wassignificantlower(P<0.05). Conclusion The expression of human telomerase reverse transcriptase and caspase- 3 in fibroblasts of keloid is abnormal, they play important roles in the abnormal proliferation and apoptosis of fibroblasts in the course of keloid.

Keloid; Human telomerase reverse transcriptase; Caspase- 3

黑龍江省青年科學(xué)基金資助項(xiàng)目(QC2011C116)

150001 黑龍江 哈爾濱，哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 整形美容中心

于冬梅(1977- )，女，黑龍江人，副主任醫(yī)師，博士研究生.

郝立君，150001，哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 整形美容中心，電子信箱：lijunhao368@163.com

10.3969/j.issn.1673- 7040.2015.03.002

R

A

1673- 7040(2015)03- 0132- 03

2014- 12- 10)