呂超男，毛文靜，馬原源，劉斌，張晉霞，孫靜，成曉華，李世英

司來(lái)吉蘭對(duì)帕金森病模型大鼠黑質(zhì)紋狀體TH及GDNF表達(dá)的影響

呂超男，毛文靜，馬原源，劉斌△，張晉霞，孫靜，成曉華，李世英

目的觀察司來(lái)吉蘭對(duì)帕金森病（PD）模型大鼠黑質(zhì)紋狀體內(nèi)酪氨酸羥化酶（TH）及膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（GDNF）表達(dá)的影響，探討司來(lái)吉蘭對(duì)多巴胺能神經(jīng)元的保護(hù)作用及機(jī)制。方法72只健康雄性SD大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組和司來(lái)吉蘭組，每組均設(shè)4 d和8 d 2個(gè)亞組，各12只。模型組和司來(lái)吉蘭組采用頸背部皮下注射魚(yú)藤酮制備PD模型，對(duì)照組皮下注射等體積葵花油。之后司來(lái)吉蘭組每日灌胃咪多吡0.5 mg/kg，模型組和對(duì)照組每日灌胃等體積生理鹽水，4 d和8 d組分別連續(xù)灌胃4 d和8 d。采用免疫組化法和Western blotting法檢測(cè)黑質(zhì)紋狀體TH和GDNF表達(dá)水平。結(jié)果免疫組化法和Western blotting法檢測(cè)結(jié)果均顯示，對(duì)照組大鼠黑質(zhì)紋狀體可見(jiàn)多量TH陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)和少量GDNF陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)，8 d和4 d組差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。模型組TH和GDNF陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)均明顯低于對(duì)照組（均P＜0.05），8 d和4 d組差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。司來(lái)吉蘭組TH陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)低于對(duì)照組而高于模型組，GDNF陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)高于對(duì)照組和模型組（均P＜0.05），且8 d組均高于4 d組（均P＜0.05）。結(jié)論司來(lái)吉蘭可減輕PD模型大鼠黑質(zhì)紋狀體多巴胺能神經(jīng)元的損傷，其作用機(jī)制可能與增加GDNF表達(dá)有關(guān)。

帕金森?。焕野彼釂窝趸?；膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子；多巴胺；單胺氧化酶抑制劑；酪氨酸羥化酶；司來(lái)吉蘭

帕金森病（Parkinson's disease，PD）是好發(fā)于中、老年人的慢性神經(jīng)系統(tǒng)變性疾?。?］，其主要病理變化是中腦黑質(zhì)紋狀體通路多巴胺能神經(jīng)元變性死亡，導(dǎo)致紋狀體內(nèi)多巴胺（DA）水平不足。研究表明膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（glial cell line-derived neurotrophic factor，GDNF）可明顯改善多巴胺細(xì)胞和神經(jīng)纖維的數(shù)量，恢復(fù)DA表達(dá)水平，運(yùn)動(dòng)癥狀也明顯改善，提示GDNF可對(duì)黑質(zhì)紋狀體起保護(hù)和修復(fù)作用，并已成為治療PD的新嘗試［2］。單胺氧化酶B （MAO-B）抑制劑能夠?qū)Ｒ恍砸种艱A分解，維持腦內(nèi)DA水平，延緩PD患者癥狀的發(fā)展，具有保護(hù)神經(jīng)的作用［3-4］。司來(lái)吉蘭作為一種選擇性的單胺氧化酶B抑制劑，能保護(hù)黑質(zhì)細(xì)胞免于各種神經(jīng)毒素的侵害［5］，但其作用機(jī)制還尚不清楚。本研究采用頸背部皮下注射魚(yú)藤酮制備PD模型大鼠，觀察司來(lái)吉蘭對(duì)PD模型大鼠黑質(zhì)紋狀體內(nèi)酪氨酸羥化酶（tyro?sine hydroxylase，TH）及GDNF表達(dá)的影響，探討司來(lái)吉蘭對(duì)多巴胺能神經(jīng)元的保護(hù)作用及其機(jī)制。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物清潔級(jí)健康雄性SD大鼠72只，體質(zhì)量250～300 g，購(gòu)自北京華阜康生物科技股份有限公司，動(dòng)物合格證編號(hào)11400500000020，設(shè)施許可證編號(hào)syxk（冀）2010-0038。在河北聯(lián)合大學(xué)屏障環(huán)境動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室自由進(jìn)食喂養(yǎng)，室溫控制在（23±2）℃，自然光照，實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)喂養(yǎng)2周。

1.1.2主要試劑及儀器鹽酸司來(lái)吉蘭（咪多吡，Eldepryl，批準(zhǔn)文號(hào)：H20040400），片劑，規(guī)格5 mg/片，產(chǎn)地：Orion Cor?poration Espoo，F(xiàn)inland；魚(yú)藤酮（批號(hào)201212）、SP-0023免疫組化試劑盒（批號(hào)201302）、兔抗大鼠TH抗體和兔抗大鼠GDNF抗體均購(gòu)自北京博奧森生物工程有限公司；DAB顯色液購(gòu)自北京中杉生物有限公司；SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳低分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)蛋白購(gòu)自華美生物公司；高速臺(tái)式離心機(jī)購(gòu)自上海安亭科學(xué)儀器廠?？ㄓ唾?gòu)自當(dāng)?shù)爻小?/p>

1.2方法

1.2.1動(dòng)物分組采用隨機(jī)數(shù)字表法將72只大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組和司來(lái)吉蘭組，3組均分別設(shè)4 d和8 d 2個(gè)亞組，每個(gè)亞組12只（其中6只用于免疫組化檢測(cè)，6只用于Western blotting檢測(cè)）。

1.2.2動(dòng)物模型制備與給藥采用頸背部皮下注射魚(yú)藤酮制備PD模型大鼠［6］。魚(yú)藤酮以葵花油配制成乳液，充分震蕩混勻后避光保存。模型組和司來(lái)吉蘭組大鼠稱(chēng)質(zhì)量后以魚(yú)藤酮2 mg/kg體質(zhì)量計(jì)算魚(yú)藤酮葵花油乳液用量。捏起大鼠頸背部皮膚，用1 mL注射器皮下注射魚(yú)藤酮葵花油乳液。對(duì)照組皮下注射等體積葵花油。行為學(xué)評(píng)分：1分，大鼠出現(xiàn)拒捕行為減弱、豎毛、毛色變黃變臟、弓背、主動(dòng)活動(dòng)減少；2分，有1分的表現(xiàn)，且主動(dòng)活動(dòng)減少明顯、動(dòng)作遲緩，并有震顫，或有步態(tài)不穩(wěn)；4分，有2分的表現(xiàn)，且步態(tài)不穩(wěn)，或不能直線(xiàn)行走、或行步時(shí)向一側(cè)旋轉(zhuǎn)；6分，向單側(cè)斜臥，單側(cè)前肢和（或）后肢癱瘓，行走困難、進(jìn)食困難；8分，單側(cè)，前肢和（或）后肢完全癱瘓，四肢拘攣，體質(zhì)量大幅度減輕，不能進(jìn)食；10分，瀕死狀態(tài)或死亡［7］。本實(shí)驗(yàn)選取2～6分大鼠入選PD模型。之后司來(lái)吉蘭組每日灌胃咪多吡0.5 mg/kg，模型組和對(duì)照組每日灌胃等體積生理鹽水，4 d和8 d 2個(gè)亞組分別連續(xù)灌胃4 d和8 d。

1.2.3標(biāo)本制備 （1）免疫組化標(biāo)本制備。用10%水合氯醛（4 mL/kg）腹腔麻醉動(dòng)物，將動(dòng)物后仰臥固定，然后開(kāi)胸，左心室穿刺，剪開(kāi)右心耳，快速灌注生理鹽水100～200 mL（4℃）至肝臟完全變白，右心耳流出澄清液體后，繼之灌入含4%多聚甲醛0.1 mol/L的PBS（pH 7.4，4℃）200～400 mL，先快后慢灌注，至大鼠肝臟變硬，肢體僵直，即固定完成，約1～2 h。然后完整取出鼠腦后再投入4%多聚甲醛0.1 mol/L的PBS（pH 7.4，4℃）過(guò)夜固定保存。然后依據(jù)大鼠腦解剖圖譜在大鼠黑質(zhì)紋狀體取材，進(jìn)行常規(guī)脫水、石蠟包埋。選擇4 μm厚度連續(xù)切片，撈片后置60℃的烤箱中烘干備用。（2）Western blotting標(biāo)本制備。用10%水合氯醛（0.3 mL/100 g）對(duì)大鼠進(jìn)行深度麻醉。斷頭后于冰上開(kāi)顱取腦，用冷的PBS漂洗殘余血，立即分離出新鮮黑質(zhì)紋狀體，將黑質(zhì)紋狀體組織置于15 mL離心管中，組織勻漿機(jī)12 000 r/min勻漿15 s，加入4℃預(yù)冷的組織裂解液，振蕩混勻，4℃作用30 min后，將細(xì)胞懸液置4℃低溫離心12 000 r/min，離心10 min后取上清液4℃保存。經(jīng)蛋白定量后分裝，用4℃預(yù)冷的PBS調(diào)蛋白濃度到一致（750 mg/L），加入等體積的上樣緩沖液，在沸水中至少煮5 min，置于4℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4檢測(cè)方法 （1）免疫組化法。取各組制備好的黑質(zhì)紋狀體組織切片，加入正常羊血清封閉液中，分別滴加兔抗大鼠TH一抗（1∶200）、兔抗大鼠GDNF一抗（1∶200）4℃過(guò)夜，滴加二抗和適量辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液，進(jìn)行DAB顯色。按試劑說(shuō)明書(shū)操作要求檢測(cè)各組TH和GDNF蛋白表達(dá)。光鏡下觀察，胞漿呈棕黃色，核呈淺藍(lán)色或紫藍(lán)色為陽(yáng)性細(xì)胞。高倍鏡下隨機(jī)分別觀察各組大鼠黑質(zhì)紋狀體不重疊的6視野，進(jìn)行TH和GDNF陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)。（2）West?ern blotting法。取各組制備好的黑質(zhì)紋狀體組織20 μg，10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）電泳分離后，以濕轉(zhuǎn)法電轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜（polyvinylidene flu?oride，PVDF）膜上。轉(zhuǎn)移緩沖液（甘氨酸5.8 g，Tris 2.9 g，SDS 0.37 g，800 mL重蒸餾水溶解后加入200 mL甲醇）。轉(zhuǎn)移后的PVDF膜放入封閉液中封閉，然后分別加入稀釋好的兔抗大鼠TH一抗（1∶500）、兔抗大鼠GDNF一抗（1∶500）4℃孵育過(guò)夜。PBS洗膜，加人相應(yīng)稀釋好的二抗（羊抗兔，1∶2 000），37℃反應(yīng)1 h，洗膜，以ECL顯色，膠片曝光顯影，使用Image J軟件進(jìn)行平均灰度值測(cè)定。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，所得數(shù)據(jù)以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD-t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1各組TH和GDNF免疫組化檢測(cè)結(jié)果對(duì)照組大鼠黑質(zhì)紋狀體可見(jiàn)多量TH陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)和少量GDNF陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)，8 d和4 d組比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。模型組TH和GDNF陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)均明顯低于對(duì)照組（均P＜0.05），8 d和4 d組比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。司來(lái)吉蘭組TH陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)低于對(duì)照組而高于模型組，GDNF陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)高于對(duì)照組和模型組（均P＜0.05），且8 d組均高于4 d組（均P＜0.05）。見(jiàn)表1，圖1、2。

Tab.1　The number of the positive expression of TH，GDNF in substantia nigra and striatum in each group表1　各組黑質(zhì)紋狀體TH和GDNF陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)?。╪=6，個(gè)/視野，±s）

Tab.1　The number of the positive expression of TH，GDNF in substantia nigra and striatum in each group表1　各組黑質(zhì)紋狀體TH和GDNF陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)　（n=6，個(gè)/視野，±s）

＊P＜0.05；a與對(duì)照組比較，b與模型組比較，P＜0.05

組別對(duì)照組模型組司來(lái)吉蘭組F TH t 4 d 79.66±2.80 50.83±5.03a66.83±5.07ab74.824＊8 d 78.16±6.40 50.33±5.16a72.33±4.41ab44.525＊0.526 0.170 2.262＊組別對(duì)照組模型組司來(lái)吉蘭組F GDNF 4 d 15.83±2.31 12.67±1.63a19.50±2.59ab14.287＊t 8 d 16.67±2.16 11.67±2.16a22.50±3.01ab26.106＊0.644 0.905 2.255＊

2.2各組TH和GDNF蛋白Western blotting檢測(cè)結(jié)果對(duì)照組大鼠黑質(zhì)紋狀體可見(jiàn)多量TH陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)和少量GDNF陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)，8 d和4 d組比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。模型組TH和GDNF陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)均明顯低于對(duì)照組（均P＜0.05），8 d和4 d組比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。司來(lái)吉蘭組TH陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)低于對(duì)照組而高于模型組，GDNF陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)高于對(duì)照組和模型組（均P＜0.05），且8 d組均高于4 d組（均P＜0.05）。見(jiàn)表2，圖3、4。

Tab.2　The expression of TH and GDNF in substantia nigra and striatum in each group表2　各組大鼠黑質(zhì)紋狀體TH和GDNF蛋白表達(dá)量?。╪=6，±s）

Tab.2　The expression of TH and GDNF in substantia nigra and striatum in each group表2　各組大鼠黑質(zhì)紋狀體TH和GDNF蛋白表達(dá)量　（n=6，±s）

＊P＜0.05；a與對(duì)照組比較，b與模型組比較，P＜0.05

組別對(duì)照組模型組司來(lái)吉蘭組F TH 4 d 24 807.00±662.86 14 866.78±785.08a19 739.33±931.58ab231.197＊8 d 24 964.00±461.39 14 061.67±599.89a20 817.17±706.01ab508.843＊t 0.476 1.995 2.259＊組別對(duì)照組模型組司來(lái)吉蘭組F GDNF 4 d 31 615.00±590.89 20 722.50±634.65a32 625.83±963.92ab466.410＊8 d 31 742.83±1 477.59 19 910.50±834.27a34 049.33±1 225.25ab236.431＊t 0.197 1.897 2.237＊

3　討論

采用頸背部皮下注射魚(yú)藤酮的方法制備PD動(dòng)物模型，能較好地模擬PD的慢性進(jìn)行性病程和發(fā)病特點(diǎn)，已被廣泛用于PD發(fā)病機(jī)制和治療的研究［8］。本研究結(jié)果顯示，造模后大鼠出現(xiàn)震顫、僵直、運(yùn)動(dòng)減少，活動(dòng)遲緩，行步時(shí)向一側(cè)旋轉(zhuǎn)等行為學(xué)改變，大鼠黑質(zhì)紋狀體的TH顯著減少，表明造模成功。

TH是腦內(nèi)最重要的一條DA遞質(zhì)通路，即黑質(zhì)-紋狀體通路的起始步驟，在DA生物合成的調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用［9］。已有研究顯示，PD模型組動(dòng)物TH陽(yáng)性神經(jīng)元較正常組動(dòng)物顯著減少［10］。本研究免疫組化法和Western blotting法檢測(cè)結(jié)果均顯示，模型組TH陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)明顯低于對(duì)照組，8 d組在數(shù)值上低于4 d組，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；司來(lái)吉蘭組TH陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)低于對(duì)照組，高于模型組，且8 d組高于4 d組，提示司來(lái)吉蘭可以減輕PD模型大鼠黑質(zhì)紋狀體多巴胺能神經(jīng)元的損傷，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，作用更明顯。

神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子在神經(jīng)元的發(fā)育、分化、生存過(guò)程中的營(yíng)養(yǎng)作用近年受到普遍重視［11］。GDNF是黑質(zhì)紋狀體通路中重要的靶源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，對(duì)多巴胺能神經(jīng)元具有高效特異性營(yíng)養(yǎng)活性，它通過(guò)增強(qiáng)細(xì)胞凋亡抑制基因的表達(dá)，并減少凋亡促進(jìn)基因的表達(dá)，保護(hù)黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元，并對(duì)其進(jìn)行修復(fù)［12］。近來(lái)有研究表明GDNF可以通過(guò)激活PI3K/ Akt通路保護(hù)多巴胺能神經(jīng)元［13］。既往研究顯示用不同方式給予PD模型動(dòng)物GDNF可以明顯改善PD癥狀［1］。司來(lái)吉蘭是一種選擇性的單胺氧化酶B抑制劑，不僅能增加抗氧化酶的濃度、減輕細(xì)胞凋亡，還可以產(chǎn)生神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，如神經(jīng)生長(zhǎng)因子（NGF）、腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（BDNF）、GDNF，阻止毒素的激活和自由基的形成，增強(qiáng)內(nèi)源性和外源性DA的作用，延緩PD進(jìn)展［14-15］。無(wú)論是用于早期PD患者的單藥治療，還是與其他PD治療藥物聯(lián)合使用，均顯示出較好的治療效果［16］。本研究的免疫組化法和Western blotting法檢測(cè)結(jié)果均顯示，模型組GDNF陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)明顯低于對(duì)照組，8 d組在數(shù)值上低于4 d組，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示GDNF在PD的發(fā)病過(guò)程中發(fā)揮重要作用；司來(lái)吉蘭組GDNF陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)高于對(duì)照組和模型組，且8 d組高于4 d組，提示司來(lái)吉蘭可以增加PD模型大鼠黑質(zhì)紋狀體GDNF陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，作用更明顯。

綜上所述，司來(lái)吉蘭可減輕PD模型大鼠黑質(zhì)紋狀體多巴胺能神經(jīng)元的損傷，其作用機(jī)制可能與增加GDNF表達(dá)有關(guān)。

（圖1～4見(jiàn)插頁(yè)）

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（2014-03-13收稿2014-10-11修回）

（本文編輯陳麗潔）

Effects of Eldepryl on TH and GDNF expressions in substantia nigra and striatum in Parkinson's disease model in rat

LYU Chaonan，MAO Wenjing，MA Yuanyuan，LIU Bin△，ZHANG Jinxia，SUN Jing，CHENG Xiaohua，LI Shiying
First Department of Neurology，the Affiliated Hospital of Hebei United University，Tangshan 063000，China
△Corresponding AuthorE-mail：liubintsh@126.com

ObjectiveTo observe the effects of Eldepryl on expressions of tyrosine hydroxylase（TH）and glial cell line-derived neurotrophic factor（GDNF）in substantia nigra and striatum in Parkinson's disease（PD）and to explore the protective mechanism of Eldepryl on dopaminergic neuron.MethodsHealthy male Sprague-Dawley（SD）rats（n=72）were randomly divided into control group，model group and Eldepryl group（n=24 in each group）.Each group was divided random?ly into 2 subgroups as 4 day treatment group and 8 day treatment group（n=12 in each subgrop）.Pakinson's disease model was established by injecting rotenone subcutaneously back the neck，rats in the control group were injected with an equal vol?ume of sunflower oil subcutaneously at the same location.Rats in the Eldepryl group were then given Eldepryl 0.5 mg·kg-1in?tragastrically every day for 4 or 8 consecutive days and rats in model group and control group were given an equal volume of saline instead.The expression of TH and GDNF in substantia nigra and striatum were detected by immunohistochemistry and Western blotting.ResultsImmunohistochemistry and Western blotting showed that strong expression of TH positive cells with little expression of GDNF positive cells were seen in substantia nigra and striatum in rats of control group，and there was no significant difference between subgroup of 8 day treatment and 4 day treatment within control group.The expression of TH cells and GDNF were both significantly reduced in model group compared with those in control group（both P＜0.05），and there was no significant difference between subgroup of 8 day treatment and 4 day treatment within each group.The ex?pression of TH positive cells were significantly reduced in Eldepryl group compared with those in control group，and were sig?nificantly increased compared with those in model group.The expression of GDNF positive cells were significantly increasedin Eldepryl group compared with those in control group and model group（all P＜0.05）.And there were significantly more ex?pression of TH positive cells and GDNF positive cells at subgroup of 8 day treatment compared with those at subgroup of 4 day treatment within Eldepryl group with（all P＜0.05）.ConclusionThese data suggest that Eldepryl can protect the dam?age of dopaminergic neurons in substantia nigra and striatum of PD rats.And its therapeutic mechanism may be associated with increased expression of GDNF.

Parkinson's disease；tyrosine 3-monooxygenase；glial cell line-derived neurotrophic factor；dopamine；monoamine oxidase inhibitors；tyrosine hydroxylase；Eldepryl

R742.5

ADOI：10.11958/j.issn.0253-9896.2015.02.011

河北省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究重點(diǎn)課題（20130064）

河北聯(lián)合大學(xué)附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)一科（郵編063000）

呂超男（1986），女，醫(yī)師，碩士，主要從事神經(jīng)變性疾病方面研究

△E-mail：liubintsh@126.com