洪敬欣，李茜，2，韓俊領，2△

人臍帶沃頓膠間充質(zhì)干細胞體外分離條件的優(yōu)化及傳代效應的流式細胞學檢測

洪敬欣1，李茜1，2，韓俊領1，2△

目的觀察不同膠原酶消化方法對人臍帶沃頓膠間充質(zhì)干細胞（mesenchymal stem cell，MSC）分離和培養(yǎng)結果的影響，并鑒定其分化潛能；探討傳代效應對其免疫表型的影響。方法將制備好的臍帶標本分別加入Ⅰ型、Ⅱ型及Ⅳ型膠原酶，持續(xù)消化4～18 h，篩網(wǎng)過濾，離心收集細胞，用DMEM/F12培養(yǎng)基重懸細胞，調(diào)整細胞密度4.8× 103～1×104/cm2，接種培養(yǎng)，比較不同消化法分離人臍帶沃頓膠MSC的效果。Von kossa鈣結節(jié)染色、四環(huán)素熒光標記鑒定人臍帶沃頓膠MSC向成骨方向分化的能力，RT-PCR鑒定其向心肌細胞分化的能力。應用流式細胞儀檢測連續(xù)傳代后MSC的免疫表型變化。結果Ⅰ型膠原酶消化法能夠從人臍帶沃頓膠獲取了數(shù)量較多、活力較高的MSC，而且細胞出現(xiàn)伸展的時間及原代培養(yǎng)時間均短于Ⅱ型膠原酶及Ⅳ型膠原酶消化法。表面標記分析顯示：隨著傳代次數(shù)的增加，陽性標記CD29、CD44、CD73、CD90、CD105的表達百分率沒有變化，而陰性標記CD31、CD34和HLA-DR的表達率增加明顯。體外誘導實驗表明：來源于人臍帶沃頓膠的MSC具有體外成骨和成心肌樣細胞分化的能力。結論Ⅰ型膠原酶消化法簡單易行，對細胞損傷小，能穩(wěn)定、高效地從人臍帶沃頓膠中分離出MSC。

臍帶；間質(zhì)干細胞；膠原酶類；傳代效應；沃頓膠

臍帶是連于胚胎臍部與胎盤間的索狀結構，外被羊膜、內(nèi)含分化的黏液性結締組織，結締組織內(nèi)除閉鎖的卵黃囊和尿囊外，還有臍動脈和臍靜脈［1］。臍帶中的間充質(zhì)干細胞（mesenchymal stem cell，MSC）可來源于沃頓膠、臍血管周圍、臍血及臍靜脈血管內(nèi)皮下，人臍帶MSC在適當?shù)恼T導條件下能向脂肪和成骨細胞分化，是理想的組織工程種子細胞。目前許多實驗室分離人臍帶MSC的方法不盡相同，主要包括膠原酶消化法、臍靜脈內(nèi)膜消化法、植塊法［2-4］，其中膠原酶消化法多以膠原酶為主。目前尚少見關于多種膠原酶消化人臍帶沃頓膠差異的報道。為進一步驗證哪種膠原酶更適宜消化人臍帶沃頓膠MSC，本研究比較了不同膠原酶消化方法對人臍帶沃頓膠MSC培養(yǎng)的影響，并觀察連續(xù)傳代后其免疫表型的變化，為其產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)及在細胞治療、組織工程等方面的應用提供依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料經(jīng)產(chǎn)婦知情同意，采集足月剖宮產(chǎn)健康胎兒臍帶30份。實驗經(jīng)采集醫(yī)院倫理委員會批準。臍帶采集之前產(chǎn)婦需做艾滋病病毒抗體、乙型肝炎病毒抗體、丙型肝炎病毒抗體、梅毒螺旋體抗體、丙氨酸轉氨酶、支原體等檢測，全部合格以確保安全后方可采集。

1.2主要儀器與試劑恒溫CO2孵箱（美國Thermo SCI?ENTIFIC）；倒置生物顯微鏡（美國 LEICA DMI3000B，日本Nikon ECLIPSE TE300）；生物顯微鏡（國產(chǎn)XSP-17C）；DMEM/F-12培養(yǎng)基、Ⅰ型膠原酶、Ⅱ型膠原酶、Ⅳ型膠原酶、胰蛋白酶、0.4%臺盼藍染液、PBS均購自美國GIB?CO；PE標記的CD73、APC標記的CD34/CD44/小鼠IgG1購自美國 GIBCO；PE標記的 CD29/CD105/小鼠 IgG1、FITC標記的 CD31/CD90/HLA-DR、APC標記的小鼠IgG1κ購自英國Serotec；地塞米松、β-甘油磷酸鈉、2-磷酸抗壞血酸、四環(huán)素染液、5-氮胞苷均購自美國Sigma；PI、RNase A購自北京賽馳生物科技有限公司；胎牛血清（澳大利亞PAA）；Von kossa染色液（上海舜百生物科技有限公司）。

1.3人臍帶沃頓膠MSC的分離臍帶剪斷雙側結扎部分，用1×PBS反復沖洗臍帶，然后將臍帶剪成1～5 mm3大小的組織塊后放入試劑瓶，每份臍帶標本平均分成3份，每份分別用以下3種方法進行分離培養(yǎng)。（1）Ⅰ型膠原酶消化法：向試劑瓶內(nèi)加入Ⅰ型膠原酶，持續(xù)消化4～18 h，篩網(wǎng)過濾，離心收集細胞。用DMEM/F12培養(yǎng)基（含體積分數(shù)為10%的FBS）重懸細胞，調(diào)整細胞密度4.8×103～1×104個/cm2，接種于6孔板內(nèi)，37℃、5%CO2恒溫孵箱內(nèi)培養(yǎng)，24 h后換液。（2）Ⅱ型膠原酶消化法：向試劑瓶內(nèi)加入Ⅱ型膠原酶，以下操作同（1）。（3）Ⅳ膠原酶消化法：向試劑瓶內(nèi)加入Ⅳ型膠原酶，以下操作同（1）。計算獲得的總細胞數(shù)及活細胞數(shù)，待細胞貼壁后達70%～80%融合時于倒置生物顯微鏡下觀察成纖維細胞集落形成單位（CFU-F），計數(shù)標準為50個細胞以上計為1個集落。

1.4人臍帶沃頓膠MSC細胞活力分析將0.5 mL細胞懸液加入試管中。按 1∶1加入0.4%臺盼藍染液，染色2～3 min。吸取少許懸液涂于載玻片上，加上蓋片。死細胞能被臺盼藍染上色，鏡下可見深藍色的細胞，活細胞不被染色，鏡下呈無色透明狀。鏡下隨機讀取任意視野分別計數(shù)死細胞和活細胞，按下面公式計算細胞活力：活細胞率（%）=活細胞總數(shù)/（活細胞總數(shù)+死細胞總數(shù)）×100。

1.5人臍帶沃頓膠MSC周期檢測將處于對數(shù)生長期的人臍帶MSC制備成單細胞懸液，1 500 r/min離心3 min；棄去上清，PBS漂洗1次，將細胞重懸于70%乙醇（-20℃預冷）中，4℃固定1 h以上；1 500 r/min離心3 min收集固定后的細胞；PBS洗滌1次，1 500 r/min離心3 min收集細胞；將細胞重懸于含100 mg/L RNase A和1×PI的PBS中，室溫孵育30 min；將經(jīng)PI染色和RNase A消化后的細胞懸液用300目的尼龍膜過濾，流式細胞儀檢測、分析。

1.6人臍帶沃頓膠MSC免疫表型檢測取P4、P7、P10、P15、P20代細胞，胰蛋白酶消化后制備成單細胞懸液，經(jīng)細胞計數(shù)后調(diào)整每管細胞總數(shù)為1×106個。100 μL PBS重懸，加入熒光標記抗體10 μL；4℃避光孵育30 min；1 500 r/min離心3 min后棄上清，PBS清洗1次以去除游離的熒光抗體；400 μL PBS輕輕混勻懸浮細胞，將細胞懸液移入FACS專用管中，進行儀器檢測和分析。

1.7細胞的多向分化潛能及分化后鑒定

1.7.1向成骨細胞分化將P5代細胞以5×104/孔接種于6孔板中，待細胞達70%～80%融合時，更換為成骨誘導培養(yǎng)液（含10%胎牛血清，1×10-7mol/L地塞米松，10 mmol/L β-甘油磷酸鈉，50 μmol/L 2-磷酸抗壞血酸的DMEM/F12培養(yǎng)液），誘導后行Von kossa染色及四環(huán)素熒光鑒定。

1.7.2向心肌樣細胞分化將P5代細胞以5×104/孔密度接種于6孔板中，待細胞達70%～80%融合時，加10 μmol/L 5-氮胞苷，24 h后立即更換為含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)液，每隔2 d換液1次，培養(yǎng)8周，提取細胞的RNA，行RT-PCR檢測人心肌轉錄因子GATA4和NKX2.5，心肌肌漿網(wǎng)鈣ATP酶、α-肌球蛋白重鏈、肌鈣蛋白I、α-橫紋肌肌動蛋白及GAPDH基因的表達。

1.8統(tǒng)計學方法結果用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計學分析，3組比較采用方差分析，組間多重比較用LSD-t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2　結果

2.1不同分離方法對人臍帶沃頓膠MSC培養(yǎng)結果的影響Ⅰ型膠原酶消化臍帶獲得的原代細胞數(shù)量多、活性高，貼壁細胞散在分布，24 h見貼壁細胞呈單層生長，伸展為短梭形、長梭形，細胞數(shù)量和細胞活力均優(yōu)于Ⅱ型和Ⅳ型膠原酶消化法，見圖1、表1。此后實驗中所采用細胞均由Ⅰ型膠原酶消化所得。

Fig.1　The primary human umbilical cord mesenchymal stromal cells in Wharton's jelly isolated by three different ways of digestion（×40）圖1　人臍帶沃頓膠MSC通過不同分離方法獲得的原代細胞（×40）

Tab.1　Comparison the cell number and vitality between three different ways of isolation of human umbilical cord mesenchymal stromal cells in Wharton's jelly表1　3種方法分離人臍帶沃頓膠MSC產(chǎn)生的細胞數(shù)量和細胞活率比較　（±s）

Tab.1　Comparison the cell number and vitality between three different ways of isolation of human umbilical cord mesenchymal stromal cells in Wharton's jelly表1　3種方法分離人臍帶沃頓膠MSC產(chǎn)生的細胞數(shù)量和細胞活率比較?。ā纒）

＊＊P＜0.01；a與（1）比較，P＜0.05

n膠原酶類型Ⅰ型膠原酶（1）Ⅱ型膠原酶（2）Ⅳ型膠原酶（3）F細胞數(shù)量（×106個）5.50±1.08 2.00±0.67a3.50±0.53a48.971＊＊細胞活率（%）95.00±2.58 71.50±1.95a59.90±3.67a400.868＊＊30 30 30

2.2人臍帶沃頓膠MSC的細胞周期情況91.67%細胞處于G0/G1期，8.33%細胞處于活化增殖狀態(tài)的S+G2+M期，見圖2。

2.3人臍帶沃頓膠MSC的免疫表型特征P4、P7、P10、P15及P20代細胞高表達黏附分子受體標記CD29、CD44，間質(zhì)細胞標記 CD73（SH3）、CD105 （SH2），及干細胞標記CD90，而低表達或不表達內(nèi)皮細胞標記CD31、造血干細胞標志CD34和組織相容性Ⅱ類抗原HLA-DR，見圖3。P15代細胞的陰性表面標記HLA-DR表達率增加4倍，P20代細胞的陰性表面標記CD31、CD34和HLA-DR的表達率明顯增高，見表2。

Fig.2　Cell cycle analysis of human umbilical cord mesenchymalstromal cells in Wharton's jelly圖2　人臍帶沃頓膠間充質(zhì)干細胞的細胞周期分析

Fig.3　Immunophenotype of umbilical cord mesenchymal stromal cells in Wharton's Jelly圖3　人臍帶沃頓膠間充質(zhì)干細胞的免疫表型檢測

Tab.2　Flow cytometry results of human umbilical cord mesenchymal stromal cells in Wharton's jelly表2　人臍帶沃頓膠MSC傳代效應的流式細胞學檢測?。?）

2.4人臍帶沃頓膠MSC的分化潛能

2.4.1成骨分化經(jīng)過21 d的誘導，顯微鏡下可見P5代人臍帶MSC可形成成骨細胞，四環(huán)素的熒光檢測可見在形成鈣結節(jié)的位置有紅色熒光信號，Von kossa染色（蘇木素復染）可見黑色礦化物沉積，見圖4。

Fig.4　Differentiation potentials of passage 5 of human umbilical cord mesenchymal stromal cells in Wharton's jelly（×100）圖4　體外誘導3周后第5代人臍帶沃頓膠間充質(zhì)干細胞的成骨分化潛能（×100）

2.4.2心肌分化經(jīng)5-氮胞苷誘導10 d，顯微鏡下觀察，細胞朝一個方向拉長為桿狀，有部分細胞出現(xiàn)死亡。誘導30 d，細胞逐漸變?yōu)槎嘟切渭靶切?，細胞增殖速度有所減緩。誘導56 d，細胞變?yōu)殡p核或多核細胞，細胞變得較寬大。RT-PCR結果表明，誘導分化的細胞有心肌細胞早期轉錄因子NKX2.5和G?ATA4及心肌肌漿網(wǎng)鈣ATP酶基因、α-肌球蛋白重鏈基因、肌鈣蛋白I基因、α-橫紋肌肌動蛋白基因的表達，而誘導前的人臍帶沃頓膠MSC均沒有這些心肌細胞的特異性基因表達，見圖5。

Fig.5　RT-PCR identification of cardiac differentiation圖5　人臍帶沃頓膠MSC的心肌分化RT-PCR鑒定

3　討論

臍帶為富含膠原和葡萄糖胺聚糖的組織，其中膠原占50%，透明質(zhì)酸占葡萄糖胺聚糖的70%［5］。Wang等［6］將去除血管的臍帶組織刮除沃頓膠組織后，膠原酶消化16 h，培養(yǎng)3 d即可觀察到成纖維樣細胞生長。Romanov等［7］和Covas等［8］對臍帶血管系統(tǒng)行酶消化，培養(yǎng)7 d觀察到成纖維樣細胞。Saru?gaser等［9］將包裹沃頓膠基質(zhì)的臍血管用膠原酶消化，可以觀察到星形的成纖維樣細胞。Mitchell等［10］用植塊法獲得了MSC，并證明了沃頓膠中的MSC具有前軟骨細胞的特性［11］。鄭志娟等［12］利用膠原酶、胰酶、透明質(zhì)酸酶、DNA酶等消化沃頓膠發(fā)現(xiàn)只消化臍帶血管收獲細胞數(shù)為（2.5～25）×104個/cm臍帶［13］。由此可見利用膠原酶消化整根臍帶組織獲得的有核細胞數(shù)最多。有研究采用植塊法分離MSC，發(fā)現(xiàn)不同個體的臍帶組織MSC爬出的時間不一致，平均需要2～3周的時間，如果采用膠原酶消化法培養(yǎng)MSC，2～3周的時間可以將細胞至少傳代1～2次［14］?；谏鲜鰣蟮篮涂紤]，本研究比較了不同膠原酶消化方法對分離人臍帶沃頓膠MSC數(shù)量、細胞活力的影響。因為臍帶組織富含膠原和透明質(zhì)酸，故實驗選擇Ⅰ、Ⅱ和Ⅳ型膠原酶消化法。結果顯示，采用Ⅰ型膠原酶消化法能從人臍帶組織中分離出活性高且數(shù)量較多的MSC，而且細胞出現(xiàn)伸展的時間及原代培養(yǎng)時間均短于使用Ⅱ、Ⅳ型膠原酶消化法。該法簡單易行，能減少MSC丟失，對細胞損傷小，培養(yǎng)成功率高，具有大規(guī)模培養(yǎng)的可能。細胞周期檢測結果顯示，91.67%細胞處于G0/G1期，8.33%細胞處于活化增殖狀態(tài)的S+G2+M期，說明細胞具有很強的增殖潛能。因為實驗采用的PI單染法，其缺點是無法區(qū)分G0期和G1期、G2期和M期。流式細胞學檢測發(fā)現(xiàn)P4、P7、P10、P15、P20均較高表達黏附分子受體標記CD29、CD44，間質(zhì)細胞標記CD73（SH3）、CD105（SH2）及干細胞標記CD90，表達率均在97%以上。此外，還發(fā)現(xiàn)10代以內(nèi)的臍帶MSC幾乎不表達內(nèi)皮細胞標記CD31、造血干細胞標記CD34和組織相容性Ⅱ類抗原HLA-DR，表達率在1%以下。但是超過10代，陰性標記表達率明顯升高，例如P15和P20代HLA-DR表達率分別為4.1%和8.9%，P20代CD31和CD34的表達率為4.1%和3%，這些均說明經(jīng)過多次傳代長期體外培養(yǎng)擴增的絕大部分MSC，都已經(jīng)是其分化的后代，即表達各種分化抗原的、已經(jīng)定向分化的間充質(zhì)細胞和終末分化而成的各種結締組織細胞。由于至今還沒有方法可以在體外純化或克隆化MSC，當前唯一的方法是體外富集MSC，即收集培養(yǎng)貼壁的細胞。因此，在收獲的間充質(zhì)細胞群中，不可避免地混雜了同樣也貼壁生長的，包括神經(jīng)干細胞或肝臟干細胞等各種成體干細胞。

由于至今尚缺乏鑒定MSC的特異性指標，所以在MSC的相關實驗設計時，需要既考慮其一系列的免疫表型，又要驗證MSC誘導分化后的細胞。本實驗在成骨誘導過程中發(fā)現(xiàn)，隨著細胞的傳代，一部分細胞會聚集成白色結節(jié)樣結構，其周圍的細胞呈放射狀。MSC可對肝星狀細胞有直接調(diào)控的效應［15］。心肌誘導實驗驗證了人臍帶沃頓膠MSC在5-氮胞苷作用下能分化為具有心肌細胞標記的細胞，但實驗未觀察到分化細胞跳動的現(xiàn)象，考慮是體內(nèi)外環(huán)境差異，影響到MSC向心肌細胞的分化，缺乏體內(nèi)心肌細胞的結構和功能，因而不能形成完全的自發(fā)跳動，這仍然需要進一步的實驗得以完善。隨著人們對MSC更深入的探索，相信MSC作為細胞和基因治療的靶細胞，以及種子細胞具有廣闊的應用前景。

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（2014-08-15收稿2014-09-20修回）

（本文編輯閆娟）

Optimization the methodology of isolating human ubilical cord mesenchymal stromal cells from Wharton's jelly and examination of their passage effect on immune phenotype using flow cytometry

HONG Jingxin1，LI Qian1，2，HAN Junling1，2△
1 Union Stem Cell&Gene Engineering Co.，Ltd.，Tianjin Cord Blood Bank，Tianjin 300384，China；2 Institute of Hematology，Blood Disease Hospital，Peking Union Medical College and Chinese Academy of Medical Sciences
△Corresponding Author E-mail:hanjl1@126.com

ObjectiveTo observe the effects of different collagenase digestions on isolating human umbilical cord mesenchymal stromal cells（MSC）from Wharton's jelly，to exam their differentiation ability and to investigate their passage effect on the immune phenotype.MethodsHuman umbilical cord samples were digested by collagenaseⅠorⅡorⅣfor 4-18 hours then were passed through sieves.Cells were collected by centrifugation then inoculated in DMEM/F12 medium at concentration within range of 4.8×103-1×104/cm2to compare the effect of different digestions on MSC.Von kossa staining and tetracycline fluorescence was used to label the osteogenic differentiation capacity of MSC.Also RT-PCR was employed to identify the differentiate capacity of MSC into myocardial-like cells.The immunophenotype of MSCs were detected by flow cytometry after subculture.ResultsUsing collagenaseⅠdigestion，the number of MSCs isolated from human umbilical cord in Wharton's jelly and their vitality were much higher while the period to show cell extension and primary culture time were shorter than those using collagenaseⅡorⅣdigestions.The analysis of surface marker revealed that the expression of positive markers include CD29，CD44，CD73，CD90 and CD105 did not change with passages while the negative markers such as CD31，CD34 and HLA-DR increased significantly with passages；Differential experiments induced in vitro show that human umbilical cord MSC in wharton's jelly had the ability to differentiate into osteoblasts and myocardial-like cells.Con?clusionThe human umbilical cord MSC in Wharton's jelly was successfully isolated by collagenaseⅠdigestion.This meth?od was simple with a high success rate while cell loss and damage were minimum.This makes large-scale cultivation possi?ble.Negative markers increased with cell passages.This phenomenon revealed that MSC showed directional differentiation.

umbilical cord；mesenchymal stem cells；collagenases；passage effect；Wharton's jelly

R394.2

ADOI：10.11958/j.issn.0253-9896.2015.02.008

1天津，協(xié)和干細胞基因工程有限公司（郵編300384）；2中國醫(yī)學科學院、北京協(xié)和醫(yī)學院，血液學研究所，血液病醫(yī)院

洪敬欣（1978），女，高級工程師，醫(yī)學博士，主要從事干細胞及免疫細胞研究

△E-mail：hanjl1@126.com