王磊磊，王丹丹，陳貫虹，孔學(xué)，鄭立穩(wěn)，王加寧△

黃藥子醇提物抑制胃癌細(xì)胞功能的研究

王磊磊1，王丹丹2，陳貫虹1，孔學(xué)1，鄭立穩(wěn)1，王加寧1△

目的研究黃藥子醇提物對人胃癌細(xì)胞增殖、克隆形成和遷移能力的影響。方法制備黃藥子醇提物，根據(jù)細(xì)胞培養(yǎng)液所含黃藥子醇提物的不同濃度，將實(shí)驗(yàn)分為黃藥子醇提物高濃度組（120 mg/L）、低濃度組（60 mg/L）和對照組（等量無菌水）。通過體外MTT、克隆形成實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)，分別檢測黃藥子醇提物對人胃癌細(xì)胞系MGC803增殖、克隆形成和遷移能力的影響。結(jié)果與對照組相比，黃藥子醇提物高濃度組和低濃度組胃癌細(xì)胞體外增殖速度明顯減慢（培養(yǎng)第2～6天時，F(xiàn)分別為29.130、21.864、67.826、36.015、43.656，均P＜0.01）、平板克隆形成率明顯減少（F=11.918，P＜0.01），黃藥子醇提物高濃度組的細(xì)胞遷移能力明顯降低（F=4.258，P＜0.05）。結(jié)論黃藥子醇提物可以顯著抑制胃癌細(xì)胞增殖、克隆形成和遷移能力，具有潛在的抑制胃癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的能力。

黃藥子；胃腫瘤；細(xì)胞增殖；集落形成單位測定；細(xì)胞遷移分析

胃癌是我國最常見的消化道惡性腫瘤之一，位居所有腫瘤致死率的第二位［1］。由于早期胃癌臨床癥狀不明顯，大部分患者就診時已處于中晚期，多數(shù)喪失了根治切除的機(jī)會［2］。目前，藥物治療是晚期胃癌治療的主要手段。中藥黃藥子為薯蕷科植物黃獨(dú)的塊莖，具有化痰散結(jié)、消癭化瘤、涼血止血、抗癌等功效［3］，是當(dāng)今治療癌癥的主要中藥之一。現(xiàn)代《中藥大辭典》記述黃藥子對甲狀腺腫瘤、食道癌、胃癌等均具有抗癌作用，但其治療胃癌的療效和藥理作用尚不明確［4］。本研究主要檢測了黃藥子醇提物對胃癌細(xì)胞系增殖、克隆形成及遷移能力的影響，為黃藥子治療胃癌的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)，同時為闡明黃藥子治療胃癌的藥理作用提供線索。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料胃癌細(xì)胞系MGC803由中山大學(xué)腫瘤防治中心提供。黃藥子（批號120512）購自濟(jì)南市漱玉平民大藥房。RPMI-1640培養(yǎng)基（Gibco公司）。胎牛血清（NBS）購自杭州四季青生物工程材料有限公司。CellTiter 96?細(xì)胞增殖檢測試劑盒（美國Promega）。牛血清白蛋白（BSA）購自廣州威佳科技有限公司。

1.2主要儀器超凈工作臺（上海整新電子設(shè)備廠），371型二氧化碳培養(yǎng)箱（賽默飛世爾科技有限公司），酶標(biāo)儀（南京歐熙科貿(mào)有限公司），GB303基本型電子天平（Mettler-Totado公司），ECLIPS 80i光學(xué)顯微鏡（日本尼康公司），CKX41倒置顯微鏡（日本Olympus公司），SORVALL LEGEND離心機(jī)（賽默飛世爾科技有限公司）。

1.3方法

1.3.1黃藥子醇提物的制備將黃藥子藥材粉碎后，水煎過濾，離心后取上清液濃縮，加入乙醇滲漏提取，過濾后離心，上清液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，稱質(zhì)量，并用蒸餾水定容（1 g/mL提取物），115℃高壓滅菌15 min，冷凍保存?zhèn)溆?，用于考察黃藥子醇提物對胃癌細(xì)胞功能的影響。

1.3.2細(xì)胞培養(yǎng)及實(shí)驗(yàn)分組胃癌細(xì)胞MGC803用含10%新生牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液培養(yǎng)，內(nèi)含100 IU/mL青霉素和100 IU/mL鏈霉素。實(shí)驗(yàn)分別設(shè)黃藥子醇提物低濃度組、高濃度組和對照組，其中低、高濃度組黃藥子醇提物濃度分別為60和120 mg/L，對照組加入等量的無菌水。將各組細(xì)胞放于37℃，飽和濕度，5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，取對數(shù)生長期細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.3胃癌細(xì)胞增殖的檢測（MTT比色實(shí)驗(yàn)） 參考文獻(xiàn)［5］方法，將對數(shù)生長期胃癌細(xì)胞消化重懸，調(diào)整濃度至2 500 個/mL，接種于96孔板，每孔200 μL，每組每天5個重復(fù)。貼壁培養(yǎng)12 h后，于第1天向細(xì)胞內(nèi)加入20 μL Cell Titer 96?AQueous One Solution Reagent，37℃5%CO2的培養(yǎng)箱培養(yǎng)2 h。空白對照為200 μL不含細(xì)胞的培養(yǎng)基，直接加入20 μL Cell Titer 96?AQueous One Solution Reagent。用酶標(biāo)儀于490 nm讀取吸光度值（A490）。重復(fù)上述操作，每24 h重復(fù)測定1次，連續(xù)測定6 d，統(tǒng)計(jì)分析并繪制胃癌細(xì)胞增殖曲線。

1.3.4胃癌細(xì)胞平板克隆形成實(shí)驗(yàn)參考文獻(xiàn)［6］方法，收集傳代的胃癌細(xì)胞懸液，調(diào)整濃度至250個細(xì)胞/mL，接種于6孔培養(yǎng)板，每孔2 mL，充分混勻，分別加入不同濃度的黃藥子醇提物，常規(guī)培養(yǎng)10 d，每組3個重復(fù)。期間每隔3 d更換新鮮培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。倒盡培養(yǎng)基，生理鹽水洗滌2遍，空氣干燥后75%乙醇固定15 min，0.5%結(jié)晶紫染色2 h，清水洗凈干燥。顯微鏡下觀察拍照，計(jì)數(shù)形成的克隆（≥50個細(xì)胞為1個克?。?。平板克隆形成率=形成克隆數(shù)/接種細(xì)胞數(shù)× 100%。細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)進(jìn)行3次生物學(xué)重復(fù)，并統(tǒng)計(jì)分析。

1.3.5胃癌細(xì)胞體外遷移實(shí)驗(yàn)取對數(shù)生長期胃癌細(xì)胞，用無血清RPMI 1640培養(yǎng)基重懸，調(diào)整濃度至1×105個細(xì)胞/ mL。在Corning Costar transwell培養(yǎng)小室上層接種200 μL細(xì)胞，上層培養(yǎng)液含0.05%的牛血清白蛋白。下層加入500 μL RPMI 1640培養(yǎng)基，分別加入不同濃度的黃藥子醇提物，每組3個復(fù)孔，37℃5%CO2培養(yǎng)48 h。取出小室，用棉簽輕輕擦凈小室內(nèi)的細(xì)胞，75%乙醇固定30 min，3%結(jié)晶紫染色30 min，洗凈后于光學(xué)顯微鏡下觀察。于400倍下隨機(jī)讀取上、下、左、右、中心共5個視野計(jì)數(shù)穿膜細(xì)胞，取各視野的均數(shù)表示胃癌細(xì)胞的體外遷移能力。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法實(shí)驗(yàn)采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，計(jì)量資料采用±s表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD-t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1黃藥子醇提物對胃癌細(xì)胞增殖的影響培養(yǎng)第1天時，各組細(xì)胞增殖率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，培養(yǎng)第2～6天時，黃藥子醇提物高濃度組和低濃度組細(xì)胞增殖能力較對照組顯著減慢（P＜0.01），見表1。

Tab.1　Alcohol extract from Dioscore bulbifera inhibit MGC803 cells proliferation shown by MTT assay表1　各組吸光度值比較?。╪=5，A490，±s）

Tab.1　Alcohol extract from Dioscore bulbifera inhibit MGC803 cells proliferation shown by MTT assay表1　各組吸光度值比較?。╪=5，A490，±s）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，a與對照組比較，b與低濃度組比較，P＜0.05

組別對照組低濃度組高濃度組F 第1天0.106±0.028 0.091±0.009 0.085±0.018 1.417 第2天0.461±0.090 0.323±0.027a0.181±0.035ab29.130＊＊第3天0.648±0.062 0.493±0.077a0.381±0.050ab21.864＊＊組別對照組低濃度組高濃度組F 第4天1.156±0.086 0.604±0.127a0.504±0.061a67.826＊＊第5天1.352±0.095 0.968±0.161a0.732±0.078ab36.015＊＊第6天1.925±0.205 1.285±0.130a0.899±0.183ab43.656＊＊

2.2黃藥子醇提物對胃癌細(xì)胞克隆形成能力的影響黃藥子醇提物高濃度組和低濃度組的平板克隆形成數(shù)量明顯少于對照組，見圖1。與對照組相比，黃藥子醇提物高濃度組和低濃度組平板克隆形成率明顯降低（F=11.918，P＜0.01），見圖2。

2.3黃藥子醇提物對胃癌細(xì)胞遷移能力的影響黃藥子醇提物高濃度組和低濃度組的胃癌細(xì)胞遷移數(shù)量明顯少于對照組，見圖3。與對照組相比，黃藥子醇提物高濃度組的胃癌細(xì)胞遷移能力明顯減弱（F=4.258，P＜0.05），見圖4。

3　討論

3.1黃藥子在臨床抗腫瘤中的應(yīng)用黃藥子是治療多種腫瘤的傳統(tǒng)中藥，具有化痰散結(jié)、消癭化瘤、清熱解毒、涼血止血等功效，其抑瘤活性成分主要包括黃藥子素A、B、C以及薯蕷皂苷等［7］。目前，臨床常用黃獨(dú)單、復(fù)方、黃獨(dú)注射液、復(fù)方黃獨(dú)注射液、黃獨(dú)藥酒、復(fù)方黃獨(dú)片、復(fù)方黃獨(dú)丸等制劑治療多種惡性腫瘤，包括消化道癌癥、肺癌、甲狀腺癌、子宮肌瘤等［7］。由于黃藥子在臨床使用過程中的不良反應(yīng)，大大限制了黃藥子特有療效的發(fā)揮。目前，對于黃藥子的有效成分及毒性成分尚不能完全確定，而且，不同極性溶劑對黃藥子提取后的藥理和毒理學(xué)作用也不盡相同［8］。黃藥子水提物的不良反應(yīng)尤其是肝毒性屢有報道［8］。有研究發(fā)現(xiàn)黃藥子醚提取物和醇提取物均具有抑制腫瘤腹水形成的作用［9］。由于醇提取方式具有雜質(zhì)少、提取率高等優(yōu)點(diǎn)，對于成分的分離更為有利，本研究采用醇提取方式提純黃藥子，檢測其對胃癌細(xì)胞一系列生物學(xué)功能的影響，探討黃藥子醇提物對胃癌細(xì)胞功能的作用。

Fig.2　Alcohol extract from Dioscore bulbifera inhibit colony formation of MGC803 cells圖2　黃藥子醇提物對胃癌細(xì)胞平板克隆形成率的影響

Fig.4　Alcohol extract of Dioscore bulbifera inhibit migration of MGC803 cells圖4　黃藥子醇提物對胃癌細(xì)胞遷移的影響

3.2黃藥子抗腫瘤作用研究近年來，黃藥子抗腫瘤作用的研究較多。Wang等［10］通過檢測黃藥子不同提取物的抗腫瘤活性，結(jié)果表明醇提物能夠抑制荷瘤鼠肉瘤細(xì)胞S180和肝癌細(xì)胞H22的瘤體質(zhì)量。黃藥子乙素可誘導(dǎo)人早幼粒白血病細(xì)胞HL-60和人表皮癌細(xì)胞A431等凋亡［7］。黃獨(dú)油對子宮頸癌（U14）有一定的抑制作用［7］。趙艷等［11］通過觀察黃藥子對人甲狀腺癌細(xì)胞株SW579凋亡抑制蛋白（Survivin）的影響，結(jié)果顯示藥物組細(xì)胞Survivin的表達(dá)明顯低于空白對照組，提示黃藥子能明顯下調(diào)Survivin的表達(dá)，誘導(dǎo)甲狀腺癌細(xì)胞凋亡。

黃藥子對胃癌細(xì)胞功能的影響及其治療胃癌的藥理作用研究較少。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與對照組相比，經(jīng)黃藥子醇提物處理后的胃癌細(xì)胞的體外增殖速度明顯減慢，平板克隆形成率明顯降低，這些結(jié)果表明黃藥子醇提物可以顯著抑制胃癌細(xì)胞的增殖和克隆形成能力。同時，黃藥子醇提物處理后的胃癌細(xì)胞體外遷移能力明顯減弱，表明黃藥子具有潛在的抑制胃癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的能力。此外，高濃度組的胃癌細(xì)胞增殖速度明顯低于低濃度組，表明增高黃藥子濃度對胃癌細(xì)胞增殖能力的抑制作用增強(qiáng)。

3.3黃藥子抗腫瘤的分子機(jī)制研究目前，關(guān)于黃藥子抑制腫瘤的分子機(jī)制研究較少。索晴等［12］通過黃藥子及黃藥子配伍當(dāng)歸后醇提物的抗腫瘤作用研究表明，黃藥子配伍當(dāng)歸后可能通過降低ATP依賴性跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（P-gp）的表達(dá)來加強(qiáng)黃藥子的抗腫瘤作用。陳翔等［8］研究表明黃藥子醇提物對裸鼠胃癌移植瘤模型有明顯的抑瘤作用，其作用機(jī)制可能與下調(diào)細(xì)胞因子白細(xì)胞介素8（IL-8）和細(xì)胞間黏附分子-1（sICAM-1）的表達(dá)有關(guān)。關(guān)于黃藥子抑制胃癌細(xì)胞功能的分子機(jī)制了解較少，有待于進(jìn)一步的深入研究。

（圖1、3見插頁）

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（2014-07-11收稿2014-10-20修回）

（本文編輯李鵬）

Inhibiting effect of alcohol extract from Dioscore bulbifera on gastric cancer cells

WANG Leilei1，WANG Dandan2，CHEN Guanhong1，KONG Xue1，ZHENG Liwen1，WANG Jianing1△
1 Biology Institute of Shandong Academy of Sciences，Jinan 250014，China；2 Shandong Academy of Medical Sciences，Shandong Medicinal Biotechnology Centre
△Corresponding Author E-mail：wangjn@sdas.org

ObjectiveTo investigate the inhibiting effects of alcohol extract from Dioscore bulbifera on proliferation，colony formation and migration of cancer cell lines.MethodsAlcohol extract from Dioscore bulbifera was prepared using Soxhlet extraction.Human gastric cancer cell line MGC803 was treated with different concentrations（0，60，120 mg/L）of al?cohol extract from Dioscore bulbifera.In vitro，proliferation，colony formation and migration of gastric cancer cells were detect?ed by MTT，colony formation experiments and Transwell assay respectively.ResultsThe proliferation（day2-day 6，F(xiàn)= 29.130，21.864，67.826，36.015，43.656，P＜0.01）and colony formation（F=11.918，P＜0.01）of gastric cancer cells were significantly inhibited by administration of alcohol extract from Dioscore bulbifera at both 60 mg/L and 120 mg/L.The migra?tion（F=4.258，P＜0.05）of gastric cancer cells were significantly suppressed after cells were treated with120 mg/L alcohol ex?tract from Dioscore bulbifera.ConclusionAlcohol extract from Dioscore bulbifera significantly inhibit proliferation，colony formation and migration of gastric cancer cells.

Dioscore bulbifera；stomach neoplasms；cell proliferation；colony-forming units assay；cell migration assay

R735.2

ADOI：10.11958/j.issn.0253-9896.2015.02.006

國家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（2011BAE06B04）

1山東濟(jì)南，山東省科學(xué)院生物研究所（郵編250014）；2山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院，山東省醫(yī)藥生物技術(shù)研究中心

王磊（1986），男，助理研究員，博士，主要從事藥物設(shè)計(jì)與有機(jī)合成研究

△E-mail：wangjn@sdas.org