善杜哈喜·巴哈提江，木拉提·克扎衣別克，地達爾·巴合提堅，帕娜爾·沙吾提巴依，熱依扎·哈斯木汗，阿依努爾·居馬拜

細胞與分子生物學

阿爾泰瑞香醇化學成分提物及其對癌細胞凋亡的誘導作用

善杜哈喜·巴哈提江，木拉提·克扎衣別克△，地達爾·巴合提堅，帕娜爾·沙吾提巴依，熱依扎·哈斯木汗，阿依努爾·居馬拜

目的檢測阿爾泰瑞香可能含有的化學成分，測定阿爾泰瑞香總酚含量，研究阿爾泰瑞香對食管癌Eca-109細胞凋亡的影響。方法采用不同化學定性方法對阿爾泰瑞香中化學成分進行研究；以沒食子酸為對照品，采用福林酚比色法測定了總酚含量；以AnnexinV-FITC/PI雙標記流式細胞術(shù)檢測腫瘤細胞凋亡情況。結(jié)果阿爾泰瑞香含有黃酮、香豆素、糖、生物堿、酚等化學成分。阿爾泰瑞香乙醇提取物（DA-Et）中總酚含量為159.78 mg/g，測定方法平均回收率為99.4%～108.3%，精密度相對標準偏差為2.04%。DA-Et處理的食管癌細胞凋亡率為（29.633± 1.779）%。結(jié)論本研究為阿爾泰瑞香質(zhì)量標準的提升與合理應用提供了參考，為深入研究阿爾泰瑞香的活性成分提供了依據(jù)。

阿爾泰瑞香；化學成分；薄層色譜；總酚；Eca-109細胞；細胞凋亡

阿爾泰瑞香為瑞香科瑞香屬植物阿爾泰瑞香（daphne altaica pall）的干燥莖皮，始載于15世紀哈薩克醫(yī)古典名著Shipagerlik Bayan中。具有發(fā)汗解表、止咳祛痰、溫中止痛的功效［1］，長期以來在哈薩克傳統(tǒng)醫(yī)學中一直用于癌癥和呼吸道疾病的治療［2］，分布于阿爾泰山脈，即新疆準噶爾盆地以北、哈薩克斯坦東部、俄羅斯的阿爾泰共和國及蒙古的西北部［3］。自20世紀70年代初，人們從瑞香科瑞香屬植物中分離出具有抗腫瘤活性的歐亞瑞香素和瑞香毒素后，該屬植物便成為一個研究熱點?，F(xiàn)代研究證實，瑞香屬植物具有抗腫瘤、鎮(zhèn)痛、抗炎、抗菌、抗血栓、鎮(zhèn)靜催眠、抗缺氧、抗瘧疾、殺蟲等作用［4］。如芫花具有抗腫瘤作用［5］；凹葉瑞香具有抗炎作用［6］；白花歐瑞香具有抗菌［7］、抗氧化［8］作用。瑞香屬植物化學成分復雜，從中分離出的化合物有香豆素類、雙黃酮類、二萜酯類、木脂素內(nèi)酯類、黃酮類、甾醇類、三萜類、苷類等，其中有明顯抗癌活性的有香豆素類（如西瑞香素［9］、瑞香素［10］），雙黃酮類（如瑞香黃烷B、瑞香黃烷G-3-甲醚、瑞香黃烷G［11］）、二萜酯類（如從芫花中分離得到的芫花黃素D、芫花黃素H、芫花黃素J［12］等）和丁香樹酯醇［13］、瑞香烯酮［14］等。為更好地發(fā)揮阿爾泰瑞香在哈薩克醫(yī)學中的應用，本文對阿爾泰瑞香化學成分進行檢測，用福林酚比色法測定總酚含量，并研究其對Eca-109細胞凋亡的影響，以期為阿爾泰瑞香質(zhì)量標準的提升與合理應用提供參考，為深入研究阿爾泰瑞香的活性成分提供依據(jù)。

1　材料與方法

1.1藥材與試劑阿爾泰瑞香（2012年7月由阿勒泰地區(qū)哈薩克醫(yī)院提供）。95%乙醇、石油醚、三氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇、瑞香素均購自SIGMA-ALORICH；西瑞香素（蕪湖甙爾塔醫(yī)藥科技有限公司），福林酚試劑（國藥集團化學試劑有限公司），沒食子酸標準品（成都曼斯特生物科技有限公司和中國科學院成都生物研究所）；RPMI1640培養(yǎng)基（GIBCO，美國）、胎牛血清（杭州四季青）、胰蛋白酶（鵬程）、DMSO（Sigma公司）、凱基AnnexinV-FITC細胞凋亡檢測試劑盒（南京建成生物工程研究所）。其余試劑如三氯化鐵試液、三氯化鐵-鐵氰化鉀試劑、濃鹽酸、鎂粉、1%三氯化鋁MeOH試液、濃NH4OH試液、改良碘化鉍鉀試劑、碘-碘化鉀試劑、碘化汞鉀試劑、20%碳酸鈉溶液等均由本實驗室自配。

1.2儀器PL4002電子天平，梅特勒-托利多儀器有限公司；UV-1750紫外分光光度計，日本津島公司產(chǎn)品；FD-1-50冷凍干燥機，上海比朗儀器有限公司；倒置熒光顯微鏡，Lei?ca，德國。

1.3乙醇提取與萃取阿爾泰瑞香將500 g的阿爾泰瑞香干燥莖皮粉碎后用體積分數(shù)為95%的乙醇于室溫下浸提3次，過濾，合并提取液，減壓濃縮得浸膏，將浸膏放入低溫冰箱內(nèi)冷凍，用冷凍干燥機干燥24 h，得阿爾泰瑞香乙醇提取物（DA-Et）粉末。粉末用水分散后依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取，所得萃取液和剩余液分別轉(zhuǎn)移至圓底燒瓶中，于40℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器減壓濃縮成濃浸膏，將浸膏冷凍，以冷凍干燥機干燥24 h，即得阿爾泰瑞香的石油醚提取物、氯仿提取物、乙酸乙酯提取物、正丁醇提取物。

1.4阿爾泰瑞香化學成分預實驗首先制備甲醇溶液：取DA-Et粉末5 g，加甲醇100 mL，20℃下超聲處理10 min，搖勻；然后進行如下實驗測定阿爾泰瑞香化學成分。

1.4.1酚類和鞣質(zhì)類 （1）三氯化鐵實驗：取檢品的甲醇溶液1 mL，加三氯化鐵試液2滴，如呈藍黑色，證明可能含有酚類化合物。（2）三氯化鐵-鐵氰化鉀實驗：取檢品的甲醇溶液點在濾紙片上，噴灑三氯化鐵-鐵氰化鉀試劑，如呈藍色斑點，證明可能含有酚類化合物。

1.4.2黃酮類 （1）鹽酸-鎂粉實驗：取檢品的甲醇溶液1 mL，加少量鎂粉，然后加濃鹽酸4～5滴，置沸水浴中加熱2～3 min，如呈桃紅色，表明可能有黃酮類化合物存在。（2）三氯化鋁實驗：取檢品的甲醇溶液點于濾紙片上（干后再點1次，使其濃度集中），干后，噴霧1%三氯化鋁甲醇試液，在紫外光燈下觀察，如呈黃色或黃綠色熒光，表明可能有黃酮類化合物存在。

1.4.3生物堿 （1）取DA-Et粉末0.5 g，置具塞錐形瓶中，精密加入濃氨水試液1 mL，靜置，浸潤1 h，精密加入三氯甲烷∶甲醇（4∶1）的混合溶劑25 mL，加熱回流3 h，放冷，過濾，濾液供做以下實驗。（2）改良碘化鉍鉀實驗：濾液加改良碘化鉍鉀試劑，觀察有無紅色沉淀生成。（3）碘-碘化鉀實驗：濾液滴加碘-碘化鉀，觀察有無暗棕色沉淀生成。（4）碘化汞鉀實驗：濾液加碘化汞鉀試劑，觀察有無淺黃色沉淀產(chǎn)生。

1.5阿爾泰瑞香中西瑞香素和瑞香素的薄層色譜鑒別制備供試品溶液：精確稱取DA-Et粉末75.24 mg，加95%乙醇1 mL，進行超聲處理10 min，搖勻即得供試品。對照品溶液：精密稱取西瑞香素0.39 mg，瑞香素0.41 mg，各加200 μL甲醇，進行超聲處理10 min，即得對照品。吸取供試品溶液和對照品溶液，分別以條帶狀點于同一氧化鋁板（10 cm×10 cm）上，以三氯甲烷∶甲醇∶水（8.5∶0.8∶0.05）為展開劑，預飽和15 min后展開，待溶液前沿距氧化鋁板前端1 cm時取出，晾干后，置紫外光燈（波長365 nm）下檢視。

1.6阿爾泰瑞香對人食管癌細胞凋亡的作用

1.6.1高糖環(huán)境培養(yǎng)的Eca-109細胞復蘇、傳代、凍存 （1）復蘇：從液氮中取出Eca-109細胞株的凍存管，將其轉(zhuǎn)移到底面積為25 cm2的培養(yǎng)瓶中，置于37℃5%CO2的孵箱中培養(yǎng)，次日觀察細胞形態(tài)。（2）傳代：細胞計數(shù)后以（2～4）×105個/mL的密度接種到新的25 cm2培養(yǎng)瓶中。置于37℃5% CO2孵箱中培養(yǎng)，每2 d換培養(yǎng)基1次。（3）凍存：選取生長期的細胞，加入凍存培養(yǎng)液（含10%DMSO），凍存液中細胞的最終密度為（5～10）×106個/mL，將細胞梯度凍存，4℃、-20℃、-45℃各梯度放置30～60 min，后轉(zhuǎn)移至-78℃冰箱過夜，24 h后轉(zhuǎn)移至液氮中長期保存。

1.6.2試藥精密稱取DA-Et粉末，加適量DMSO溶解。待藥物完全溶解后，取50 μL，于12 000 r/min離心10 min，取40 μL，加入60 μL的DMSO，使最終濃度為100 g/L。將培養(yǎng)好的食管癌細胞以1×106個/μL接種到培養(yǎng)板中，培養(yǎng)24 h后用新鮮培養(yǎng)基換液，加0.5 μL的DA-Et后培養(yǎng)24 h，共設3個平行組。

1.6.3流式細胞技術(shù)檢測食管癌細胞凋亡情況收集處理24 h的細胞（培養(yǎng)至80%融合時），用0.25%胰蛋白酶消化，用PBS洗2次（2 000 r/min離心5min）。加入500 μL的Binding Buffer懸浮細胞搖勻；室溫，避光反應5～15 min后用流式細胞儀檢測，激發(fā)波長為488 nm。

1.7阿爾泰瑞香總酚含量測定

1.7.1相關(guān)溶液配制 （1）20%碳酸鈉溶液：精密量取20 g碳酸鈉，置100 mL容量瓶用純水溶解并稀釋至刻度。（2）對照品溶液：精密稱取5 mg沒食子酸對照品，置50 mL容量瓶用純水溶解并稀釋至刻度。精密量取該溶液15 mL，用純水定容至50 mL，即得對照品溶液30 mg/L。（3）樣品溶液：稱取0.05 g DA-Et粉末加入100 mL純水，40℃加熱超聲溶解25 min，冷卻。分別精密量取7.5 mL樣品溶液共5份，用純水定容至10 mL。

1.7.2檢測波長的確定精密吸取沒食子酸對照品溶液2.5 mL和供試品溶液1.0 mL，分別置于10 mL容量瓶中，加入純水至5.0 mL，加入0.5 mL福林酚試劑，搖勻6 min后加入20%碳酸鈉溶液1.5 mL，用純水定容至10 mL，室溫下避光反應2 h。以試劑溶液為空白，于500～900 nm波長處進行掃描。

1.7.3標準曲線的繪制精密量取上述對照品溶液0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 mL于10 mL容量瓶中，加入純水至5 mL，加入0.5 mL Folin-Ciocalteu試劑，搖勻6 min后加入20%碳酸鈉溶液1.5 mL，用純水定容至10 mL，室溫下避光反應2 h。以第1個溶液為空白，在745 nm波長處測定對照品溶液的吸光度，以對照品的含量為橫坐標，以吸光度為縱坐標，繪制標準曲線。

1.7.4精密度實驗精密量取同一批已知濃度的供試品溶液5份，每份1.0 mL，分別按1.7.3中的方法，以試劑溶液為空白對照，進行含量測定，重復3次。

1.7.5加樣回收率實驗精密量取同一批已知濃度的供試品溶液10份，每份1.0 mL，分2組，一組各加入沒食子酸對照品溶液0.5 mL，另一組各加入1.0 mL，分別按1.7.3項方法下顯色，以試劑溶液為空白對照，進行含量測定，重復3次，并計算回收率。

1.7.6DA-Et中總酚含量測定及重現(xiàn)性實驗取5份DAEt，每份約3.75 mg，加入10 mL純水于40℃加熱超聲溶解25 min，冷卻。各取供試品溶液1.0 mL，分別按1.7.3中的方法測定并計算總酚含量（mg/g）=C/10 m；C為10 mL供試品溶液中總酚濃度（g/L），m為供試品取樣量（g）。

2　結(jié)果

2.1阿爾泰瑞香化學成分初步分析結(jié)果DA-Et中可能含有黃酮、生物堿、酚類化合物，見表1。

Tab.1　Chemical constituent of Daphne altaica pall表1　阿爾泰瑞香化學成分

2.2薄層色譜實驗結(jié)果供試品與對照品在同一薄層板相應的位置上，顯相同的斑點，見圖1。

Fig.1　TLC of UV chromatogram圖1　365 nm紫外光下（A）和日光下（B）的色譜圖

2.3流式細胞檢測食管癌細胞凋亡結(jié)果Annexin V-FITC/PI雙參數(shù)圖上可見經(jīng)DA-Et處理后的Eca-109細胞在Annexin V-FITC+、PI-象限中的分布顯著，見圖2。DA-Et處理后的細胞凋亡率為（29.633±1.779）%。

Fig.2　The apoptosis rate of esophageal cancer cell line after treatment of DA-Et圖2　DA-Et處理后的食管癌細胞凋亡檢測圖

2.4總酚含量的測定結(jié)果沒食子酸對照品溶液在745 nm波長處有最大吸收，供試品溶液在此波長也有最大吸收，故檢測波長為745 nm，見圖3。

Fig.3　Absorbtion spectrogram of sample and standard solution圖3　樣品與沒食子酸對照品的吸收光譜圖比較

2.4.2精密度實驗結(jié)果顯示該方法精密度相對標準差為2.04%，說明此方法穩(wěn)定性良好。

2.4.3加樣回收率實驗結(jié)果加樣回收率為99.4%～108.3%，表明此方法測定結(jié)果準確度較高，見表3。

Tab.3　Recovery rate of sample solution表3　供試品溶液的加樣回收率

2.4.4DA-Et總酚含量測定及重現(xiàn)性實驗DA-Et中總酚含量為（159.78±1.90）mg/g，相對標準差為1.19%，表明具有很好的重現(xiàn)性。

3　討論

阿爾泰瑞香作為哈薩克民間常用藥之一，在治療風寒感冒、氣管炎、咳嗽、胃痛不適、關(guān)節(jié)炎、咽痛、牙痛、食管癌、胃癌方面有著很獨特的療效。雖然阿爾泰瑞香在哈薩克傳統(tǒng)醫(yī)學中已用于食管癌等惡性腫瘤的治療，國內(nèi)外也有有關(guān)黃瑞香、唐古特瑞香等瑞香屬植物的研究報道，但其抗腫瘤有效部位及有效成分不明確，尚未見有關(guān)阿爾泰瑞香化學成分及藥理作用的文獻報道和相關(guān)發(fā)明專利。

本實驗通過薄層色譜鑒別及化學成分系統(tǒng)預實驗，初步檢定了阿爾泰瑞香可能含有黃酮、香豆素、糖、生物堿、酚類化合物等成分，以沒食子酸為對照品，采用福林酚比色法測定阿爾泰瑞香中的總酚含量，此方法具有操作簡便快捷，設備要求低，穩(wěn)定性和重現(xiàn)性好等優(yōu)點，是檢測阿爾泰瑞香總酚的可靠方法。用Annexin-V單陽性細胞為凋亡細胞，An?nexin-V與PI雙陽性為壞死細胞，雙陰性細胞為活細胞分析DA-Et處理24 h的食管癌細胞的凋亡，從實驗結(jié)果中可以看到DA-Et具有明顯的誘導凋亡作用。對阿爾泰瑞香的抗癌物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機制進行研究具有較大實際意義和較高的學術(shù)價值。本研究豐富了阿爾泰瑞香化學成分的研究資料，為今后深入研究哈薩克藥資源的調(diào)查，提升阿爾泰瑞香質(zhì)量標準，研究阿爾泰瑞香抗癌機制提供了可借鑒的科學依據(jù)。

［1］Xu X，Huangerhan B.The Kazakh Pharmacopeia［M］.Bei Jing:Eth?nic Press Of China，2009:33-35.［徐新，巴哈爾古麗·黃爾汗.哈薩克藥志［M］.北京：民族出版社，2009：33-35］.

［2］Kizaibek M，Daniar M，Li L，et al.Antiproliferative activity of differ?ent extracts from Daphne altaica Pall on selected cancer cells［J］.J Med Plants Res，2011，5（15）:3448-3452.

［3］Bahaerguli，Kulixiaxi.Folk prescription and aplication of the tradi?tional kazakh medicine daphne altaica pall［J］.Lishizhen Medicine and Materia Medica Research，2008，19（4）:1028-1029.［巴哈爾古麗，庫里夏西.哈薩克族民間用藥阿爾泰瑞香的民間處方及應用［J］.時珍國醫(yī)國藥，2008，19（4）:1028-1029］.

［4］Zhang W，Liu RH，Zhang C，et al.Studies on chemical constituents from daphne genus and their pharmacological activities and clinical application［J］.Progress in Pharmaceutical Science，2005，29（1）:22-27.［張薇，柳潤輝，張川，等.瑞香屬植物化學成分及其藥理與臨床作用的研究［J］.藥學進展，2005，29（1）:22-27］.

［5］Zhan ZJ，F(xiàn)an CQ，Ding J，et al.Novel diterpenoids with potent in?hibitory activity against endothelium cell HMEC and cytotoxic activ?ities from a well-known TCM plant Daphne genkwa［J］.Bioorg Med Chem，2005，13（3）:645-655.

［6］Hu X，Jin H，Xu W，et al.Anti-inflammatory and analgesic effects of Daphne retusa Hemsl［J］.J Ethnopharmacol，2008，120:118-122.

［7］Cottiglia F，Loy G，Garau D，et al.Antimicrobial evaluation of cou?marins and flavonoids from the stems of Daphne gnidium L［J］. Phytomedicine，2001，8:302-305.

［8］Cerrati C，Mallet JF，Ucciani E，et al.Alpha-Tocopherol，a major antioxidant in Mediterranean plants［J］.Rivista Italiana delle Sostan?ze Grasse，1992，69:317-320.

［9］Li YM，Zhu L，Jiang JG，et al.Bioactive components and pharmaco?logical action of wikstroemia indica（L.）CA Mey and its clinical ap?plication［J］.Curr Pharm Biotechnol，2009，10（8）:743-752.

［10］Finn GJ，Creaven BS，Egan DA.Daphnetin induced differentiation of human renal carcinoma cells and its mediation by p38 mitogenactivated protein kinase［J］.Biochem Pharmacol，2004，67（9）:1779-1788.

［11］Zheng W，Gao X，Gu Q，et al.Antitumor activity of daphnodorins from Daphne genkwa roots［J］.Int Immunopharmacol，2007，7（2）: 128-134.

［12］Zhan ZJ，F(xiàn)an CQ，Ding J，et al.Novel diterpenoids with potent inhib?itory activity against endothelium cell HMEC and cytotoxic activi?ties from a well-known TCM plant Daphne genkwa［J］.Bioorg Med Chem，2005，13（3）:645-655.

［13］Park BY，Oh SR，Ahn KS，et al.（-）-Syringaresinol inhibits prolifera?tion of human promyelocytic HL-60 leukemia cells via G1 arrest and apoptosis［J］.Int Immunopharmacol，2008，8（7）:967-973.

［14］Zhang W，Zhang WD，Liu RH，et al.Two new chemical constituents from Daphne odora Thunb.var.marginata［J］.Nat Prod Res，2006，20 （14）:1290-1294.

（2014-07-15收稿2014-09-10修回）

（本文編輯閆娟）

Chemical constituents of ethanol extracts from Daphne altaica pall and their pro-apoptotic role in cancer cell

BAHYTJAN Sandugash，KIZAIBEK Murat△，BAHYTJAN Didar，SAWYTBAI Panar，KASYMKAN Ryza，JUMABAI Ainur
Traditional Kazakh Medicine Research Institute of Ili Kazakh Autonomous Prefecture，TCM Hospital of Ili Kazakh Autonomous Prefecture，Yili 835000，China
△Corresponding Author E-mail：murat_kizaibek@sina.com

ObjectiveTo investigate the chemical constituents of the ethanol extract of Daphne altaica Pall（DA-Et），to determine total phenolic content in DA-Et and to study the effect of DA-Et on cell apoptosis in Eca-109 cells.Meth?odsDifferent chemical assays were performed to detect chemical constituents of DA-Et.The content of total phenolics，ex?pressed as gallic acid equivalents，was measured by Folin-Ciocalteu assay；Cell apoptosis induced by DA-Et was detected by AnnexinV-FITC/PI flow cytometry.ResultsFlavonoids，coumarins，sugars，alkaloids and phenolics in DA-Et.The contents of total phenolics in DA-Et was quantified as 159.78 mg/g.Average recovery rate of this method ranged from 99.4%to 108.3%and the precision relative standard deviation was 2.04%.Apoptosis rate of Esophageal cancer cell line Eca-109 induced by DA-Et was detected as 29.633%±1.779%（n=3）.ConclusionOur study provide guidance for the im?provement of DA-Et quality，its appropriate application and further research of its activity.

Daphne altaica Pall.；chemical constituents；TLC；total phenolics；Eca-109 cells；cell apoptosis

R282，R735.1

ADOI：10.11958/j.issn.0253-9896.2015.02.004

國家自然科學基金資助項目（81360499）；新疆地產(chǎn)中藥民族新藥研發(fā)項目（XJHPHY-2010-YH）；自治區(qū)科研機構(gòu)創(chuàng)新發(fā)展專項資金（2013002）；伊犁哈薩克自治州科技計劃項目（YZ201201034）

伊犁哈薩克自治州哈薩克醫(yī)藥研究所、伊犁哈薩克自治州中醫(yī)醫(yī)院（郵編835000）

善杜哈喜·巴哈提江（1990），女，學士學位，主要從事哈薩克藥研究

△E-mail：murat_kizaibek@sina.com