郭玉巖，孟令超，呂邵娃，王 銳，李永吉

(黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，哈爾濱150040)

鹽酸青藤堿為防己科防己屬植物青風(fēng)藤主要成分－青藤堿的鹽酸鹽，具有顯著的抗炎、鎮(zhèn)痛、抗風(fēng)濕等作用，主要用于風(fēng)濕及類風(fēng)濕性疾病的治療[1].但由于其具有釋放組胺作用而致皮疹、胃腸道不適等副作用，使其體內(nèi)給藥受到限制[2].本文以鹽酸青藤堿為主要成分，加適宜輔料，制備成經(jīng)皮給藥制劑(鹽酸青藤外敷散)[3－4]，將本產(chǎn)品直接作用于患處，增加炎性關(guān)節(jié)局部藥物質(zhì)量濃度、提高療效的同時(shí)，降低藥物的毒副作用[5].由于局部給藥制劑藥物吸收入血量較少、且很難客觀評(píng)價(jià)藥物在局部病灶組織的吸收情況，為此本文對鹽酸青藤外敷散局部貼敷給藥后在局部炎性組織的吸收情況進(jìn)行研究，總結(jié)鹽酸青藤外敷散在局部病變部位局部藥動(dòng)學(xué)行為，用以評(píng)價(jià)鹽酸青藤堿局部經(jīng)皮給藥制劑的性能.

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 儀器與試劑

主要儀器有Waters 2690高效液相色譜儀(美國Waters公司);組織勻漿機(jī) MINI－16(Bead Beater公司);D－37520超速低溫離心機(jī)(德國Heraeus公司)

鹽酸青藤外敷散(黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)藥劑學(xué)實(shí)驗(yàn)室自制);青藤堿對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號(hào):0774－201206);色譜純甲醇、乙腈(美國，Dikma);角叉菜膠(美國，Sigma);其他試劑為市售分析純.

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

Wistar大鼠，雌雄各半，體重180～220 g，合格證號(hào):P00102009，由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，(生產(chǎn)許可證SCXK黑2008004).

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

Kromasil C18色譜柱(4.6 mm ×250 mm);流動(dòng)相為磷酸緩沖鹽(0.01 mol/L磷酸氫二鉀溶液，加1‰三乙胺，磷酸調(diào)pH值3.0)－甲醇(80∶20);檢測波長為265 nm;流速為1.0 mL/min，柱溫30℃，進(jìn)樣量 10 μL.

2.2 對照品溶液制備

取經(jīng)105℃干燥至恒重的青藤堿對照品約3.0 mg，精密稱定 2.82 mg，置 100 mL 量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得.

2.3 組織樣品的制備及處理

取健康的Wistar大鼠，左后足底皮下注射1%角叉菜膠(0.l mL/只)，30 min后，將青防腫痛外敷散貼于造模足跖處，固定.24 h后，將其給藥足剪下置于組織勻漿管中，依次加入氯化鈉溶液3 mL及甲醇溶液2 mL勻漿3次，離心.取上清液置25 mL量瓶中，甲醇溶液定容，離心5 min(轉(zhuǎn)速5 000 r/min)，取上清液5 mL置10 mL量瓶中，用甲醇定容，離心，取上清液濾過，進(jìn)樣測定即可.

2.4 方法學(xué)驗(yàn)證

1)專屬性考察

按比例加入有關(guān)組織及相關(guān)輔料，按“2.1.3”制成相當(dāng)于供試品質(zhì)量濃度的空白溶液，經(jīng)高效液相色譜法測定，結(jié)果表明輔料、試劑均無干擾，專屬性良好.

2)精密度試驗(yàn)

取對照品溶液10 μL連續(xù)進(jìn)樣6次，測定其峰面積，計(jì)算偏差.RSD為0.58%，精密度良好.

3)最低檢測限、定量限

精密稱取青藤堿對照品2.5 mg，甲醇定容至25 mL，取1 mL定容至10 mL逐級(jí)稀釋，按照“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，得檢測限為 0.8 μg/mL，定量限為 2.5 μg/mL.

4)標(biāo)準(zhǔn)曲線

精密稱取青藤堿對照品7.05 mg，置25 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，作為儲(chǔ)備液(質(zhì)量濃度為 0.282 mg/mL).取 1、2、4、8 mL 分別置100 mL量瓶中，同時(shí)再取1、2 mL置于10 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度.得質(zhì)量濃度分別為0.002 82、0.005 64、0.011 28、0.022 56、0.028 2、0.056 4 mg/mL的對照品溶液，按照1.2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣10 μL，測定峰面積.以對照品質(zhì)量濃度(x)對峰面積(y)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為:y=8×106+1 315.4(R=0.999 9)，結(jié)果表明在 0.002 82～0.056 4 mg/mL范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好.

5)準(zhǔn)確度

精密稱取青藤堿對照品約7.1 mg，置10 mL量瓶中，加甲醇使其溶解并稀釋至刻度，作為儲(chǔ)備液.分別精密移取儲(chǔ)備液各1 mL及稱取適量供試品，共同放置于已有剪碎的大鼠足部的勻漿管中，共9份.按“2.1.3”項(xiàng)下方法處理，使質(zhì)量濃度為測定質(zhì)量濃度的80%、100%、120%各3份.進(jìn)樣測定，測得回收率為100.6%在98% ～102%范圍內(nèi)，RSD為1.9%，證明回收率良好.

6)樣品穩(wěn)定性

按“2.1.3”方法制備供試品，分別放置 0、2、4、8、10、12 h，測定其峰面積，計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)偏差，結(jié)果RSD為1.25%，樣品穩(wěn)定性良好.

2.5 青防腫痛外敷散局部藥動(dòng)學(xué)研究

Wistar大鼠80只，體重180～220 g，雌雄各半，實(shí)驗(yàn)前 12 h禁食不禁水.將大鼠按“2.1.3”項(xiàng)下方法給藥，每天換藥1次，每天處死4只，連續(xù)定時(shí)取材20 d，測定每天藥物的吸收情況.采用PKSolver藥動(dòng)學(xué)軟件獲得相關(guān)藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)及吸收曲線;AUC0－t為梯形法計(jì)算值，Cssmax、Cmin為實(shí)測值，平均穩(wěn)態(tài)血藥質(zhì)量濃度(Cssav)為根據(jù)公式Cssav=AUC0－t/t計(jì)算所得，穩(wěn)態(tài)谷質(zhì)量濃度(Cssmin)為實(shí)測的4個(gè)谷質(zhì)量濃度的平均值，波動(dòng)度(DF)為根據(jù)公式DF(%)=(Cssmax－ Cssmin)/Cssav×100%計(jì)算所得.用SPSS 18.0進(jìn)行成組t檢驗(yàn)的對照分析.研究結(jié)果見表1、2，圖1、2.

表1 局部吸收藥量測定結(jié)果(±S)

表1 局部吸收藥量測定結(jié)果(±S)

注:“—”代表未檢出

時(shí)間/d 動(dòng)物數(shù)/只 組織局部吸收量/mg 百分含量/%4 0.069 3 ±0.009 1 1.71 2 4 0.386 1 ±0.006 5 9.53 3 4 0.282 0 ±0.018 0 6.96 4 4 0.189 4 ±0.0006 4.68 5 4 0.345 9 ±0.010 0 8.54 6 4 0.297 3 ±0.005 7 7.34 7 4 0.229 9 ±0.001 2 5.68 8 4 0.312 6 ±0.019 0 7.72 9 4 0.250 9 ±0.014 0 6.19 10 4 0.219 7 ±0.001 6 5.42 11 4 0.299 7 ±0.001 6 7.40 12 4 0.244 5 ±0.019 0 6.03 13 4 0.186 9 ±0.017 0 4.61 14 4 0.228 1 ±0.001 1 5.63 15 4 0.217 2 ±0.011 0 5.36 16 4 0.171 6 ±0.016 0 4.23 174——184——194——20 4 1——

圖1 局部吸收藥量曲線

圖2 局部吸收藥量擬合曲線

表2 相關(guān)藥動(dòng)學(xué)參數(shù)

3 討論

局部給藥與口服給藥相比，僅有少量的藥物被吸收進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)，而且由于消除與新陳代謝行為藥物質(zhì)量濃度下降很快[6]，在局部給藥系統(tǒng)中，血漿中藥物質(zhì)量濃度與藥理效應(yīng)沒有直接關(guān)系，所以本文選擇采用測定多次給藥后局部病變部位全組織藥物質(zhì)量濃度，來評(píng)價(jià)外用給藥在給藥部位藥物的動(dòng)態(tài)行為.經(jīng)數(shù)據(jù)擬合及藥動(dòng)學(xué)參數(shù)計(jì)算可知，藥物穩(wěn)態(tài)后的吸收質(zhì)量濃度范圍為0.21～0.39 mg/mL之間，平均穩(wěn)態(tài)質(zhì)量濃度為0.24 mg/mL.DF值為75%，波動(dòng)度適宜，未超出治療范圍.

由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，大鼠足部中鹽酸青藤堿的吸收量3 d為一個(gè)波動(dòng)期，13 d以后趨于平衡，至16 d后，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物足部吸收量較少，低于定量限以下.分析其原因可能是本品所用輔料中含有醋酸，長時(shí)間貼敷給藥，醋酸可使皮膚組織蛋白凝固壞死，增加了皮膚的角質(zhì)化，因此根據(jù)實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象觀察，在連續(xù)給藥16 d后，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物給藥部位已嚴(yán)重角質(zhì)化，不能再繼續(xù)吸收藥物，導(dǎo)致檢測量較低.

藥物的透皮吸收不同于其他的吸收過程，藥物從給藥部位進(jìn)入到體循環(huán)要經(jīng)過一系列的動(dòng)態(tài)過程，因此它的吸收不屬于一級(jí)動(dòng)力學(xué)，不會(huì)出現(xiàn)明顯的“峰谷”現(xiàn)象[7－8].局部藥動(dòng)學(xué)研究顯示，炎性部位吸收最高藥量出現(xiàn)在給藥后第2天.分析原因在于大部分藥物透過皮膚去對抗炎性因子，只有少量的藥物進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)，這就證明了鹽酸青藤堿等藥物局部給藥用于治療關(guān)節(jié)炎等類疾病的優(yōu)點(diǎn).也就是說較少的藥量在局部即可發(fā)揮較強(qiáng)的藥效.此外，鹽酸青藤堿局部給藥的毒副作用在與口服給藥對比時(shí)易被忽視，所以對于藥物累計(jì)、質(zhì)量濃度隨時(shí)間變化等還需要進(jìn)一步具體的研究.

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