魏 寧，郎偉君，2

(1.哈爾濱商業(yè)大學(xué)藥學(xué)院，哈爾濱150076;2.哈爾濱樂(lè)泰藥業(yè)有限公司，哈爾濱150025)

甘草為豆科植物甘草、脹果甘草、光果甘草的根及根莖，具有補(bǔ)脾益氣、清熱解毒、祛痰止咳、緩急止痛、調(diào)和諸藥的功能[1].甘草的主要化學(xué)成分為三萜皂苷類(lèi)和黃酮類(lèi)，其中甘草酸、甘草苷分別是其重要的單體活性成分，具有很強(qiáng)的藥理活性[2].

本文以甘草酸和甘草苷的提取率為指標(biāo)，對(duì)提取溶劑的選擇和最佳方法進(jìn)行考察，旨在為甘草用于化妝品并實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)提供參考.

1 儀器與試藥

高效液相色譜儀(日本島津公司):SPDM20A型二極管陣列檢測(cè)器、LC－10ATvP型泵、DGU－20A3型脫氣器、CBM－20A型系統(tǒng)控制器、SIL－20A型自動(dòng)進(jìn)樣器、LC solution色譜工作站、Diamonsil－C18色譜柱(5 μm，150 mm × 4.6 mm)(迪馬公司).

甘草藥材(哈藥集團(tuán)世一堂制藥廠，經(jīng)哈爾濱商業(yè)大學(xué)藥學(xué)院張德連副教授鑒定為真品);甘草酸單銨鹽對(duì)照品(批號(hào):111089－201301)、甘草苷對(duì)照品(批號(hào):111610－201301)均購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品鑒定所;甲醇、乙腈、冰乙酸為色譜純，水為雙蒸水，無(wú)水乙醇為分析純.

2 方法與結(jié)果

2.1 甘草酸和甘草苷的質(zhì)量濃度測(cè)定

2.1.1 色譜條件

1)甘草酸

色譜柱:Diamonsil－ C18柱(5 μm，150 mm ×4.6 mm);流動(dòng)相:甲醇 －0.2 mol/L 醋酸銨溶液 －冰醋酸(67∶33∶1);檢測(cè)波長(zhǎng):250 nm;流速:1 mL/min，進(jìn)樣量:10 μL.

2)甘草苷

色譜柱:Diamonsil－ C18柱(5 μm，150 mm ×4.6 mm);流動(dòng)相:乙腈 －0.5%冰醋酸(1∶4);檢測(cè)波長(zhǎng):276 nm;流速:1.0 mL/min;進(jìn)樣量:20 μL.

2.1.2 對(duì)照品溶液的制備

1)甘草酸

精密稱(chēng)取甘草酸單銨鹽對(duì)照品5 mg，置于5mL量瓶中，用流動(dòng)相溶解并稀釋至刻度，搖勻即得.

2)甘草苷

精密稱(chēng)取甘草苷對(duì)照品1.25 mg，置于5 mL量瓶中，加甲醇制成每1 mL含250 μg的溶液.

2.1.3 供試品溶液的制備

1)甘草酸

精密量取各提取液1 mL，置50 mL量瓶中，加流動(dòng)相約20 mL，超聲處理30 min，加流動(dòng)相稀釋至刻度，精密量取續(xù)濾液10 mL，置25 mL量瓶中，加流動(dòng)相稀釋至刻度，取續(xù)濾液，測(cè)定并計(jì)算;

2)甘草苷

精密量取各提取液1 mL，置具塞錐形瓶中，精密加入70%乙醇溶液10 mL，超聲處理30 min，補(bǔ)足減失的重量，精密量取續(xù)濾液1 mL，置50 mL量瓶中，用20%乙腈稀釋至刻度，取續(xù)濾液，測(cè)定并計(jì)算.

2.1.4 線性關(guān)系考察

1)甘草酸

精密吸取對(duì)照品溶液 0.25、0.50、0.75、1.00、1.50 mL，分別置于5 mL容量瓶中，流動(dòng)相稀釋?zhuān)瑩u勻.分別精密吸取10 μL注入液相色譜儀進(jìn)行分析.以甘草酸單銨鹽對(duì)照品的進(jìn)樣質(zhì)量濃度(C)對(duì)其峰面積積分值(A)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程:A=3811.1C+683.15(r=0.999 8)，結(jié)果表明，甘草酸單銨鹽對(duì)照品的進(jìn)樣質(zhì)量濃度在50～300 μg/mL的范圍內(nèi)與其峰面積積分值呈良好線性關(guān)系.

2)甘草苷

精密吸取對(duì)照品溶液 0.25、0.50、0.75、1.00、1.50 mL，分別置于5 mL容量瓶中，甲醇稀釋?zhuān)瑩u勻.分別精密吸取20 μL注入液相色譜儀進(jìn)行分析.以甘草苷對(duì)照品的進(jìn)樣質(zhì)量濃度(C)對(duì)其峰面積積分值(A)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程:A=19 003C+10 174(r=0.999 7)，結(jié)果表明，甘草苷對(duì)照品的進(jìn)樣質(zhì)量濃度在6.25～37.5 μg/mL的范圍內(nèi)與其峰面積積分值呈良好線性關(guān)系.

2.2 提取工藝研究

2.2.1 不同提取溶劑的選擇

根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[3]和2010年版《中國(guó)藥典》(一部)，結(jié)合實(shí)際生產(chǎn)的需要，對(duì)不同提取溶劑進(jìn)行篩選.選取水和65%的乙醇作為提取溶劑，以甘草酸和甘草苷的提取率為評(píng)價(jià)指標(biāo)進(jìn)行比較，提取方法:1)水煎煮法:甘草粗粉50 g，用20倍量水煎煮3次，每次1.5 h，合并煎液，離心，傾取上清液，濃縮至50 mL，測(cè)定;2)乙醇回流提取法:甘草粗粉50 g，用6倍量65%的乙醇回流提取3次，每次1.5 h，合并提取液，回收乙醇至無(wú)醇味，濃縮至50 mL，測(cè)定.不同提取溶劑下甘草酸和甘草苷的提取率見(jiàn)表1.

表1 不同提取溶劑下甘草酸和甘草苷的提取率

由表1可知，水煎煮法的總提取物得率比65%乙醇回流提取法的總提取物得率高一些，但65%乙醇回流提取法的甘草苷和甘草酸的提取率都比水煎煮法的高很多，綜合結(jié)果優(yōu)選65%的乙醇作為提取溶劑.

2.2.2 優(yōu)化乙醇回流提取工藝

選用正交試驗(yàn)，優(yōu)化乙醇回流提取條件.根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)選取乙醇體積分?jǐn)?shù)(A)、溶媒用量(B)、提取時(shí)間(C)、提取次數(shù)(D)4個(gè)因素，每個(gè)因素選3個(gè)水平，采用L9(34)正交設(shè)計(jì)，以甘草酸和甘草苷的提取率綜合值為指標(biāo)進(jìn)行考察，綜合值=(甘草酸提取率+甘草苷提取率)/2.因素水平見(jiàn)表2;正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3;方差分析結(jié)果見(jiàn)表4.

表2 甘草乙醇回流提取因素水平表

表3 正交實(shí)驗(yàn)方案與結(jié)果

表4 方差分析結(jié)果

由表3直觀分析可知，各因素對(duì)提取效果的影響依次為D＞C＞B＞A，優(yōu)化水平是A2B3C3D3;由表4方差分析可知，提取次數(shù)(D)對(duì)甘草酸、甘草苷提取效果的影響有顯著意義(P＜0.05).以總提取物得率為考察指標(biāo)時(shí)，直觀分析表明各因素對(duì)提取效果的影響依次為D＞C＞B＞A，優(yōu)化水平是A2B3C3D3;方差分析表明，B、C、D三種因素對(duì)總提取物得率的影響均有顯著意義(P＜0.05);乙醇體積分?jǐn)?shù)(A)對(duì)甘草酸、甘草苷的提取率，總提取物得率的影響均無(wú)顯著意義.為降低大批量生產(chǎn)成本，決定選用 55%乙醇(A1)，則最佳工藝為A1B3C3D3，即6倍量55%乙醇，回流提取3次，每次1.5 h.該結(jié)果與正交試驗(yàn)中綜合值最高者的搭配A1B3C3D3一致.

2.2.3 驗(yàn)證試驗(yàn)

稱(chēng)取甘草50 g，按最佳工藝A1B3C3D3進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，測(cè)得甘草酸、甘草苷提取率分別為73.41%、74.18%，接近正交試驗(yàn)方案中的最高值，優(yōu)化條件可行.

3 結(jié)語(yǔ)

有文獻(xiàn)報(bào)道[4]，甘草酸用氨水提取效果好.甘草苷易溶于有機(jī)溶劑，多用乙醇提取.通過(guò)查閱文獻(xiàn)和預(yù)實(shí)驗(yàn)，并從甘草用于化妝品工業(yè)化生產(chǎn)和安全角度考慮，本試驗(yàn)綜合優(yōu)選乙醇作為提取溶劑，確定乙醇體積分?jǐn)?shù)、溶媒用量、提取時(shí)間和提取次數(shù)為考察因素，通過(guò)驗(yàn)證放大實(shí)驗(yàn)表明，正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)選確定的最佳工藝水平是科學(xué)、可行的，有利于實(shí)際生產(chǎn)降低能源、節(jié)約時(shí)間，故確定甘草乙醇回流提取的最佳工藝為A1B3C3D3，即6倍量55%乙醇，回流提取3次，每次1.5 h.

[1]國(guó)家藥典委員會(huì).中國(guó)藥典(一部)[M].北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010.80－81.

[2]張明發(fā)，沈雅琴，張艷霞.甘草及其有效成分的皮膚藥理和臨床應(yīng)用[J].藥物評(píng)價(jià)研究，2013，36(2):146－156.

[3]劉育辰，王文全，郭洪祝.甘草有效成分的提取純化方法研究進(jìn)展[J].中成藥，2010，32(11):1953－1957.

[4]杜文彬，張 洪.甘草中甘草酸的提取工藝研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科技，2008，36(25):10935－10946.