張振國(guó)，鄒 翔，徐 陽(yáng)，王 震，劉 影，趙靜文，張逸喬，曲中原，季宇彬

(1.哈爾濱商業(yè)大學(xué)英才學(xué)院，哈爾濱150028;2.哈爾濱商業(yè)大學(xué)生命科學(xué)與環(huán)境科學(xué)研究中心，哈爾濱150076;3.哈爾濱商業(yè)大學(xué)藥學(xué)院，哈爾濱150076)

《陸川本草》記載曇花[Epiphyllum oxypeta lum(DC.)]又名瓊花、月下美人，屬仙人掌科曇花屬植物，其花、莖入藥.曇花(Epiphyllum Flos)具有清肺止咳、涼血止血、養(yǎng)心安神之功效.主治肺熱咳嗽、肺癆、咯血、崩漏、心悸、失眠等癥[1].目前對(duì)曇花的研究主要集中在植物栽培和化妝品應(yīng)用方面[2－3]，而對(duì)其藥用價(jià)值并沒(méi)有深入研究.中國(guó)科學(xué)院上海藥物研究所吳斌等人對(duì)其化學(xué)成分進(jìn)行初步研究，從曇花甲醇提取物的乙酸乙酯萃取部分分離出9個(gè)化合物，主要為黃酮類(lèi)成分[3].黃酮類(lèi)化合物具有多種生物活性，在食品和醫(yī)藥工業(yè)上有著廣泛的應(yīng)用.目前關(guān)于曇花黃酮類(lèi)化合物的提取和活性研究還未見(jiàn)報(bào)道.本實(shí)驗(yàn)旨在單因素考查實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，通過(guò)正交試驗(yàn)優(yōu)化曇花總黃酮的提取工藝，為進(jìn)一步的藥理活性研究及曇花藥用植物資源的充分利用和合理開(kāi)發(fā)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù).

1 實(shí)驗(yàn)儀器與藥品

FW135、177中草藥粉碎機(jī)(天津市泰斯特儀器有限公司);KQ5200DB型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(北京普斯通用儀器有限公司);HH－2數(shù)顯恒溫水浴鍋(江蘇省壇市榮華儀器制造有限公司);98－1－B電子調(diào)溫電熱套(天津市泰斯特儀器有限公司);BS110S電子分析天平(北京賽多利斯天平有限公司);RE－52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海亞榮生化儀器廠);SHZ－III循環(huán)水多用真空泵(上海亞榮生化儀器廠).

曇花(Epiphyllum Flos)藥材為仙人掌科植物曇花[Epiphyllum oxypeta lum(DC.)]的干燥花，購(gòu)于福建省泉州，為初秋采集花，經(jīng)哈爾濱商業(yè)大學(xué)藥學(xué)院張德連教授鑒定.金絲桃苷對(duì)照品購(gòu)于天津一方可以有限公司，純度98%以上.乙醇為分析純.

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 樣品預(yù)處理

取干燥曇花，粉碎，過(guò)40目篩，待用.

2.2 曇花總黃酮的提取

精密稱(chēng)取處理好的樣品粉末(40目)5.00g于圓底燒瓶中，按照一定的料液比、提取次數(shù)、提取時(shí)間、提取溫度水浴回流提取.提取2次，合并提取液轉(zhuǎn)至旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至小體積，移至蒸發(fā)皿，水浴蒸干，用70%乙醇溶解定容至100 mL.

2.3 單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

乙醇體積分?jǐn)?shù) 精密稱(chēng)取5.00 g曇花粉末5份，固定提取溫度為80℃，料液比為1∶30，提取時(shí)間為3 h，分別加入體積分?jǐn)?shù)為50%，60%，70%，80%，95%的乙醇溶液進(jìn)行回流提取.

提取溫度精密稱(chēng)取5.00 g曇花粉末5份，固定提取溶劑為70%乙醇，料液比為1∶30，提取時(shí)間為3 h，提取溫度分別為50、60、70、80、90 ℃進(jìn)行回流提取.

提取時(shí)間精密取5.00 g曇花粉末5份，提取溫度為80℃，提取溶劑為70%乙醇，料液比為1∶30，提取時(shí)間為 3 h，分別設(shè)定 2、3、4、5、6 h 進(jìn)行回流提取.

料液比 精密稱(chēng)取5.00 g曇花粉末5份，提取溫度為80℃，提取溶劑為70%乙醇，提取時(shí)間為3 h，料液比分別為 1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60 進(jìn)行回流提取.

2.4 曇花總黃酮提取工藝的正交試驗(yàn)優(yōu)化

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，以乙醇體積分?jǐn)?shù)(A)、提取溫度(B)以及提取時(shí)間(C)為實(shí)驗(yàn)因素進(jìn)行考察，按照L9(34)正交表進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步優(yōu)化曇花總黃酮的提取工藝.因素水平如表1所示.

表1 實(shí)驗(yàn)因素水平L9(34)表

2.5 曇花總黃酮百分含量測(cè)定

2.5.1 金絲桃苷標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

精密稱(chēng)取金絲桃苷對(duì)照品10.00 mg，用無(wú)水乙醇定容至100 mL，則金絲桃苷對(duì)照品溶液的質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL.準(zhǔn)確移取對(duì)照品溶液0、0.1、0.15、0.2、0.25、0.3、0.4、0.5 mL 至 10.00 mL容量瓶，分別加蒸餾水定容至10 mL，混勻，放置15 min后，用紫外分光光度計(jì)在378 nm處測(cè)量其吸光度[4－5]，以吸光值為縱坐標(biāo)，金絲桃苷質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線.線性回歸方程為 y=26.73x+0.016(r=0.999 6)，金絲桃苷在 0.01 ～0.06 mg/mL范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系.

2.5.2 方法學(xué)考察

1)精密度實(shí)驗(yàn) 取金絲桃苷對(duì)照品溶液(0.1 mg/mL)在378 nm波長(zhǎng)處連續(xù)6次測(cè)定吸光度，RSD值為0.17%，表明本實(shí)驗(yàn)精密度良好.

2)穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取同一質(zhì)量濃度的供試品溶液，于 0，2，4，8，10，24 h 測(cè)定吸光度值，RSD 為0.11%，表明供試品溶液至少在24 h內(nèi)穩(wěn)定.

3)重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 精密稱(chēng)取5.00 g曇花粉末6份，分別采用80%乙醇熱回流提取，提取溫度為90℃，提取4 h，料液比為 1∶40(m/V)，提取 2次，按照“2.2”項(xiàng)下制備成供試品溶液，在378 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值.RSD值為0.58%，表明實(shí)驗(yàn)重復(fù)性良好.

4)加樣回收率實(shí)驗(yàn)精密量取曇花粉末(總黃酮百分含量為1.15%)6份，每份 0.1 g，分別加入金絲桃苷對(duì)照品約1 mg，分別采用80%乙醇熱回流提取，提取溫度為70℃，提取4 h，料液比為1∶40(m/V)，提取 2 次，按照“2.2”項(xiàng)下制備成供試品溶液，在378 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值，計(jì)算加樣回收率為(97.10±1.38)%，RSD 值為1.03%，表明百分含量測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確.

3 結(jié)果與討論

3.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

單因素考察結(jié)果顯示當(dāng)80℃熱回流提取，料液比1∶30，提取3 h時(shí)，乙醇體積分?jǐn)?shù)為80%提取的總黃酮百分含量最高;當(dāng)取70%乙醇，料液比1∶30，提取3 h時(shí)，提取溫度為80℃提取的總黃酮百分百分含量最高;當(dāng)80℃ 70%乙醇熱回流提取，料液比1∶30時(shí)，提取時(shí)間為6 h的總黃酮百分含量最高;當(dāng)80℃70%乙醇熱回流提取3 h時(shí)，料液比大于1∶40(m/V)時(shí)曇花總黃酮百分含量增加趨于平緩，基本穩(wěn)定.見(jiàn)表2.

表2 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.2 正交試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取溫度以及提取時(shí)間的較好水平進(jìn)行正交試驗(yàn)，進(jìn)一步優(yōu)化曇花總黃酮的提取工藝.正交試驗(yàn)結(jié)果如表3所示.從分析結(jié)果來(lái)看，乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取溫度和提取時(shí)間對(duì)曇花總黃酮的百分含量均有影響，影響的大小順序?yàn)?乙醇體積分?jǐn)?shù)＞提取溫度＞提取時(shí)間.根據(jù)正交試驗(yàn)的結(jié)果(總黃酮的百分含量)，得出曇花總黃酮提取的最佳實(shí)驗(yàn)條件為A2B3C2，即乙醇體積分?jǐn)?shù)為80%，提取溫度為90℃，提取時(shí)間為4 h.

3.3 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

按照優(yōu)選出來(lái)的最佳工藝條件進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，測(cè)定平均總黃酮百分含量為 1.18%，RSD為1.84%，工藝穩(wěn)定.見(jiàn)表3、4.

表3 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表4 正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析

4 結(jié)語(yǔ)

通過(guò)以上研究可知乙醇體積分?jǐn)?shù)，提取溫度、提取時(shí)間以及料液比對(duì)曇花總黃酮的百分含量均有影響.正交試驗(yàn)確定的因素影響的大小順序?yàn)橐掖俭w積分?jǐn)?shù)＞提取溫度＞提取時(shí)間.曇花總黃酮提取的最佳實(shí)驗(yàn)條件為乙醇體積分?jǐn)?shù)80%，提取溫度90℃，提取時(shí)間4 h，料液比1∶40(m/V)，提取2次.該工藝操作簡(jiǎn)便、可行，為曇花總黃酮的工業(yè)化生產(chǎn)提供科學(xué)依據(jù)，為曇花作為藥用資源進(jìn)行開(kāi)發(fā)和利用奠定基礎(chǔ).

[1]國(guó)家中醫(yī)藥管理局《中華本草》編委會(huì).中華本草[M].上海:上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，1999.864－865.

[2]SUZAKI S.Moisturizing effect of Gekkabijin(Epiphyllum oxypetalum Haw.)extract[J].Fragra J，2005，33(10):51 －56.

[3]吳 斌，林文輝.曇花化學(xué)成分的研究[J].中國(guó)藥學(xué)雜志，2010，45(7):496－499.

[4]曾秀燕，魯梅玉，楊常宏，等.醋柳黃酮中總黃酮及槲皮素、異鼠李素的含量測(cè)定[J].中國(guó)醫(yī)院藥學(xué)雜志，2005，25(12):1122－1124.

[5]張 慧，王 遂.雙水相法和微波法提取假酸漿中總黃酮及純化[J].哈爾濱商業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版，2014，30(2):220－223