謝冬微，路穎，趙德寶，楊學(xué)，粟建光，孫健，

(1.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所，哈爾濱150030;2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院麻類研究所，長(zhǎng)沙410205;3.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，哈爾濱150030)

植物對(duì)于識(shí)別和響應(yīng)病原菌 (病毒、真菌、細(xì)菌)具有復(fù)雜的機(jī)制。誘導(dǎo)防御響應(yīng)被病原體無(wú)毒性 (avr)基因和植物抗病基因 (R)的特異相互作用所調(diào)節(jié)。R和avr基因在植物識(shí)別和抵御病原菌方面起著非常重要的作用[1－2]。近些年來(lái)，大量的R基因已經(jīng)從一些植物中被克隆獲得，R蛋白能直接或間接地作用于病原誘導(dǎo)物并啟動(dòng)抗病基因下游的級(jí)聯(lián)防衛(wèi)反應(yīng)[3]。R基因被視為植物的廣譜抗病基因，通常該類基因中會(huì)包含有一些非常保守的結(jié)構(gòu)域[1，4]。

絕大多數(shù)R基因編碼的蛋白具有編碼核苷酸結(jié)合位點(diǎn) (nucleotide－binding site，NBS)和富亮氨酸重復(fù)蛋白 (leucine－rich－repeat，LRR)結(jié)構(gòu)域的特點(diǎn)[4]，NBS結(jié)構(gòu)域中包含的保守基序可以將NBS類基因分成不同的亞組[5－7]。在植物R蛋白中NBS區(qū)域負(fù)責(zé)結(jié)合ATP和GTP[8]，而LRR區(qū)域在植物中表現(xiàn)出直接或間接的抗病作用[9]。此外，LRR區(qū)域還被證明參與結(jié)合病原感應(yīng)器和調(diào)解信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[10]。NBS－LRR基因家族根據(jù)其N末端結(jié)構(gòu)的不同被分成兩個(gè)亞家族[11]，一個(gè)亞家族是由TIR－NBS－LRR(TNL)組成，其編碼的序列N末端具有TIR(Toll/白細(xì)胞介素－1受體類似結(jié)構(gòu))，另外的一個(gè)亞家族是由CC－NBS－LRR(CBL)組成，其編碼序列的N末端不具有TIR，但卻有卷曲的螺旋 (Coiled－coil CC)結(jié)構(gòu)域[12]。

亞麻 (Linum usitatissimum)是人類最早使用的植物天然纖維及油料作物，是重要的經(jīng)濟(jì)作物之一。2012年，Wang等[13]報(bào)道非冗余的重疊群組裝后獲得302Mb的亞麻全基因組數(shù)據(jù)大約覆蓋了亞麻基因組的81%以上，多達(dá)96%的已報(bào)道的亞麻EST序列被比對(duì)到全基因組測(cè)序得到的scaffolds上，且預(yù)測(cè)得到43384個(gè)編碼功能蛋白的基因。這為系統(tǒng)分析亞麻抗病基因提供了一個(gè)前所未有的機(jī)會(huì)[13]。許多病害 (包括白粉病[14]，炭疽病[15]及枯萎病[16]等)都會(huì)引起亞麻大面積的減產(chǎn)，所以提高亞麻抗病性問(wèn)題急需解決。

近年來(lái)，植物基因組測(cè)序飛速進(jìn)展，人們已經(jīng)可以在基因組水平上對(duì)植物重要基因家族進(jìn)行挖掘、比較分析和功能預(yù)測(cè)。本研究通過(guò)生物信息學(xué)方法在亞麻基因組全序列測(cè)定完成的基礎(chǔ)上，對(duì)亞麻全基因組中的NBS類基因進(jìn)行分類和系統(tǒng)發(fā)生學(xué)分析。以期更加深入和全面的了解亞麻抗性相關(guān)的基因，進(jìn)而加快亞麻中抗病基因的克隆以及抗病機(jī)制的研究，并為植物抗病育種提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本研究以亞麻為研究對(duì)象，亞麻全基因組數(shù)據(jù)下載于 phytozome網(wǎng)站 (http://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html#!info?alias=Org_Lusitatissimum)中的最新數(shù)據(jù)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 NBS類基因的鑒定和分類

利用phytozome網(wǎng)站中的亞麻基因組數(shù)據(jù)庫(kù)，鑒定亞麻中的NBS類基因的方法與粳稻和栽培稻日本晴相同[17，19]。通過(guò)Pfam(http://pfam.sanger.ac.uk)鑒定候選抗病基因所編碼的 TIR(Toll/白細(xì)胞介素－1受體類似結(jié)構(gòu))、NBS以及LRR結(jié)構(gòu)域，將不含以上三種結(jié)構(gòu)域之一及測(cè)序存在問(wèn)題的候選基因序列排除;其次，通過(guò)COILS Server(http://www.ch.embnet.org/software/COILS_form.html)鑒定NBS類抗病基因的CC(coiled－coil)結(jié)構(gòu)域 (閥值為0.9)[18]。

1.2.2 NBS類基因的Scaffold位點(diǎn)定位及蛋白分析

通過(guò)phytozome網(wǎng)站查詢所有入選的NBS類基因的Scaffold位點(diǎn)信息，并下載所有基因的蛋白序列，利用expasy網(wǎng)站 (http://web.expasy.org/compute_pi/)預(yù)測(cè)NBS類蛋白序列的分子量和等電點(diǎn)信息。

1.2.3 NBS類基序結(jié)構(gòu)及基因結(jié)構(gòu)的分析

對(duì)NBS類抗病基因的每個(gè)保守基序進(jìn)行鑒定，通過(guò)將完整的NBS類基因的蛋白序列輸入到MEME網(wǎng)站 (http://meme.nbcr.net/meme/intro.html)在線分析，參數(shù)設(shè)置:基序?qū)挾葹?X50，鑒定最大基序數(shù)量為20。利用Gene Structure Display Server(http://gsds1.cbi.pku.edu.c n/)在線分析NBS類基因的基因結(jié)構(gòu)，分別將每個(gè)基因的CDS序列及基因組DNA序列輸入以上網(wǎng)站進(jìn)行分析及繪圖。

1.2.4 NBS類基因的系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

首先將含有NBS結(jié)構(gòu)和不含該結(jié)構(gòu)域的序列分存于兩個(gè)文件中，然后利用Clustal x軟件分別對(duì)兩個(gè)文件中的序列進(jìn)行比對(duì)分析，將比對(duì)結(jié)果輸入MEGA5.0軟件構(gòu)建兩個(gè)系統(tǒng)進(jìn)化樹，并對(duì)其進(jìn)行人工修飾。

2 結(jié)果分析

2.1 亞麻NBS－LRR類抗病基因的鑒定及分類

在亞麻基因組中最終鑒定得到137個(gè)NBS類基因，其中有83個(gè)帶有NBS結(jié)構(gòu)域的基因和54個(gè)結(jié)構(gòu)域不完整的NBS類基因 (僅含有LRR或TIR結(jié)構(gòu)域)。而含有NBS結(jié)構(gòu)域的基因又可以進(jìn)一步被分為七組，分別為CC－NBS－LRR(1個(gè))、NBS－LRR(3個(gè))、CC－NBS(11個(gè))、NBS(12個(gè))、TIR－NBS－LRR(14個(gè))、TIR－NBS－LRR－X(28個(gè))及 TIR－NBS(14個(gè))，而不含有NBS結(jié)構(gòu)域的基因可分為兩組，即為L(zhǎng)RR(26個(gè))和TIR(28個(gè))。

目前為止，許多植物NBS－LRR抗病基因家族已經(jīng)得到研究，不同植物NBS－LRR抗病基因的總數(shù)量以及各個(gè)亞組中基因數(shù)量分布都有所不同，水稻中共發(fā)現(xiàn)519個(gè)NBS－LRR抗病基因，其中304個(gè)為TN亞家族基因，160個(gè)為CNL亞家族基因，NL亞家族中的基因數(shù)量幾乎是CNL亞家族的兩倍[19]，而雙子葉植物擬南芥和苜蓿NL亞家族基因數(shù)量較少，CNL和TNL亞家族基因數(shù)量較多，這與亞麻的NBS－LRR基因分類比例十分相似，這說(shuō)明NBS－LRR家族基因在雙子葉和單子葉植物中的分類是有明顯區(qū)別的。

表1 NBS類基因保守結(jié)構(gòu)域分類Tab.1 Conserved domain classification of NBS genes

2.2 NBS類基因在Scaffolds上的分布及蛋白理化特性

盡管學(xué)者們已經(jīng)對(duì)亞麻全基因進(jìn)行了測(cè)序且將信息上傳至phytozome網(wǎng)站，但并未公布測(cè)序亞麻品種的染色體物理圖譜。所以我們無(wú)法將預(yù)測(cè)的NBS類基因定位到亞麻的染色體組上。本研究發(fā)現(xiàn)亞麻NBS類家族基因分布并不均勻，出現(xiàn)成簇分布的現(xiàn)象，在Scaffold106、Scaffold2057、Scaffold630、Scaffold472、Scaffold132、Scaffold416、Scaffold917及 Scaffold15中發(fā)現(xiàn)3個(gè)NBS類基因存在，而在Scaffold280中有4個(gè)，Scaffold77中有5個(gè) (見(jiàn)表2)。因此，這些基因成簇存在的Scaffold將是進(jìn)一步研究亞麻抗病基因的重點(diǎn)區(qū)段。

在以上的研究中，得出NBS類家族基因在scaffolds上分布是不均勻的。對(duì)蛋白分子量和等電點(diǎn)的分析結(jié)果表明，分子量大于100kDa占有的序列比例在50%以上，占總基因數(shù)的比例較大(見(jiàn)表3)，由于高分子量的蛋白質(zhì)不論是用于質(zhì)譜鑒定，還是用于基因的遺傳轉(zhuǎn)化難度都比較大，這些高分子量的蛋白序列可能會(huì)給后續(xù)的研究工作帶來(lái)一定的阻礙，所以在接下來(lái)的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和具體操作的過(guò)程中要對(duì)這部分基因多加考慮。與NBS類家族蛋白質(zhì)的分子量的結(jié)果相比較，其等電點(diǎn)分布規(guī)律性顯得較為明顯，主要分布在pH值在5～8的范圍內(nèi)，所占比例為70.07%(見(jiàn)表4)。這表明極酸或極堿的蛋白相對(duì)較少，這有利于后續(xù)的實(shí)驗(yàn)研究和分析。

表2 部分NBS類家族基因基本信息Tab.2 Basic information of some NBS gene families

表3 亞麻NBS－LRR家族蛋白質(zhì)分子量統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)表Tab.3 Protein molecular weight data sheet of flax NBS－LRR family

表4 亞麻NBS－LRR家族蛋白質(zhì)等電點(diǎn)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)表Tab.4 Protein isoelectric point data sheet of flax NBS－LRR family

2.3 亞麻NBS類家族基因系統(tǒng)進(jìn)化分析

利用Clustal X和Mega軟件構(gòu)建了兩個(gè)關(guān)于亞麻中NBS類家族基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹 (圖1－A，B)。其中一個(gè)是有83個(gè)含有NBS結(jié)構(gòu)域的基因構(gòu)成的系統(tǒng)進(jìn)化樹圖1－A，該進(jìn)化樹將83個(gè)基因分成了5個(gè)亞組，每個(gè)亞組中包含13～28個(gè)NBS類基因不等，其中TNLX亞組含有NBS類基因最多為28個(gè)，N亞組最少為13個(gè)。而如圖1－B所示，不含NBS結(jié)構(gòu)域的NBS類基因 (即結(jié)構(gòu)域不完整的NBS類基因)被分成兩個(gè)亞組，分別為僅含TIR結(jié)構(gòu)域組和僅含LRR結(jié)構(gòu)域組。綜合以上兩個(gè)系統(tǒng)進(jìn)化樹，本研究中的137個(gè)NBS類家族基因被分成7個(gè)亞組，分別代表著具有不同抗病結(jié)構(gòu)域的組合。由此我們推測(cè)不同亞組中的抗病基因可能對(duì)病原菌的侵襲具有不同的抵抗能力，該觀點(diǎn)有待于進(jìn)一步的試驗(yàn)驗(yàn)證。

圖1 亞麻NBS類基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.1 The phylogenetic tree of flax NBS genes

2.4 NBS類家族基因的基因結(jié)構(gòu)分析

亞麻NBS類家族基因的CDS和基因組DNA序列在phytozome網(wǎng)站下載得到，通過(guò)GSDS(http://gsds.cbi.pku.edu.cn/index.php)網(wǎng)站進(jìn)行基因內(nèi)含子和外顯子位置的預(yù)測(cè) (圖2)。本研究中除了34個(gè)NBS類基因沒(méi)有內(nèi)含子外，其余103個(gè)基因均含有1～19個(gè)不等的內(nèi)含子。NBS類家族基因的內(nèi)含子分布情況與進(jìn)化樹分類十分吻合，我們發(fā)現(xiàn)分屬于進(jìn)化樹中TNLX、TIR及LRR亞組的NBS類基因所含有的內(nèi)含子平均長(zhǎng)度較其它亞組更長(zhǎng)，分在同一亞組中的基因結(jié)構(gòu)十分相似，說(shuō)明同亞組內(nèi)的基因間的進(jìn)化相對(duì)保守。但不同亞組之間的基因無(wú)論從內(nèi)含子數(shù)量還是基因組DNA長(zhǎng)度上都存在明顯差異，這表明亞麻NBS類基因經(jīng)歷了不同的復(fù)制和演變進(jìn)而導(dǎo)致基因結(jié)構(gòu)存在著豐富的多樣性。

2.5 亞麻NBS類家族基因的基序分析

利用MEME在線工具對(duì)亞麻NBS類蛋白序列進(jìn)行了保守基序分析，結(jié)果表明，亞麻NBS類蛋白具有20類保守基序，長(zhǎng)度變化較大，在15～50個(gè)氨基酸之間，這說(shuō)明了NBS類家族基因成員之間保守性相對(duì)較高。我們進(jìn)一步分析了這些保守基序在亞麻NBS類蛋白中的分布情況(圖3)，發(fā)現(xiàn)大部分NBS類基因都含有20個(gè)保守基序，也有少部分基因出現(xiàn)保守基序缺失的情況。缺失最明顯的就是分類于TIR和LRR兩個(gè)亞組的NBS類基因，由于這兩個(gè)亞組成員可能在亞麻全基因組測(cè)序拼接的時(shí)候組裝的并不完整，導(dǎo)致其缺失了部分功能區(qū)，但它們?nèi)赃€有與抗病密切相關(guān)的一部分保守結(jié)構(gòu)域且這類基因的數(shù)目較多，在本研究中達(dá)到54個(gè)，因此，它們也是研究亞麻抗病基因不可或缺的部分。

3 討論

NBS類抗病基因是植物基因組中最大的家族之一，同時(shí)也是所含基因數(shù)目最多的抗病基因家族。目前，由于部分植物基因組測(cè)序的相繼完成，這為學(xué)者們從基因組水平上對(duì)植物的NBS類抗病基因進(jìn)行研究提供了基礎(chǔ)。因此，亞麻作為主要的經(jīng)濟(jì)作物和已測(cè)序的作物之一，對(duì)其NBS類抗病基因進(jìn)行研究也是必要且切實(shí)可行的。亞麻中共鑒定了137個(gè)NBS類抗病基因，并且根據(jù)這些基因所含結(jié)構(gòu)域的不同，將它們進(jìn)一步分成了7個(gè)亞組，亞麻的NBS類抗病基因各亞組基因的分布數(shù)目各不相同，這與擬南芥和苜蓿[20]等雙子葉植物NBS類抗病基因家族基因分布情況類似 (見(jiàn)表1)，而與水稻[21]中抗病基因的分布差異較大。由此，我們發(fā)現(xiàn)單雙子葉植物中NBS類抗病基因種類的分布差異明顯，這種不均勻分布可能與不同類型植物長(zhǎng)期進(jìn)化過(guò)程中適應(yīng)生存環(huán)境的結(jié)果有關(guān)?；蚪Y(jié)構(gòu)分析表明，NBS類家族基因成員間由于具有不同的內(nèi)含子數(shù)目及長(zhǎng)度而導(dǎo)致基因結(jié)構(gòu)產(chǎn)生差異，推測(cè)這些差異產(chǎn)生的原因可能是在這些基因演化的過(guò)程中發(fā)生了內(nèi)含子的插入或缺失。而對(duì)于NBS類抗病基因的保守基序分析我們發(fā)現(xiàn)，在進(jìn)化樹中被分在同一組的基因在保守基序的種類和排布上非常相似，這也進(jìn)一步印證了進(jìn)化樹分類的可靠性。在亞麻NBS類抗病基因家族中，被克隆并報(bào)道的基因數(shù)目并不多，絕大部分基因的功能到目前為止還不清楚。本研究通過(guò)生物信息學(xué)方法總括了亞麻全基因組中的NBS類抗病基因的分類、系統(tǒng)發(fā)生及基因結(jié)構(gòu)等，對(duì)于發(fā)掘新的與植物抗性相關(guān)的基因，加快亞麻中抗病基因的克隆以及抗病機(jī)制的研究具有十分重要的意義，也為亞麻的抗病育種研究奠定了基礎(chǔ)。

圖2 亞麻NBS類家族基因的基因結(jié)構(gòu)示意圖Fig.2 Schematic diagram of the gene structure of flax NBS gene families

圖3 亞麻NBS類家族基因的保守基序圖Fig.3 Conserved motif graph of flax NBS gene families

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