宋喜霞

(黑龍江省農業(yè)科學院經濟作物研究所，哈爾濱150086)

亞麻枯萎病是由尖孢鐮刀菌亞麻專化型[Fusarium oxysporum Schl.f.sp.lini(Bolley)]引起的一種真菌病害，普遍發(fā)生在各亞麻種植地區(qū)。一般發(fā)病率為20%～30%左右，嚴重時可達40%以上，甚至絕產，嚴重影響亞麻產量和纖維質量[1]。鐮刀菌毒素是鐮刀菌產生的能引起植物萎蔫的一種代謝產物，是鐮刀菌病害致病的主要原因之一[2]。

研究表明亞麻枯萎病毒素對亞麻種子萌發(fā)和胚根的生長有明顯的抑制作用，可用作亞麻枯萎病抗性材料的篩選[3]。目前國內外小麥、辣椒、西瓜等作物已利用鐮刀菌毒素對植物組織離體篩選抗逆種質，在篩選抗病資源和改良品質育種方面都取得了可喜成就[4－6]。本試驗對尖孢鐮刀菌亞麻?；圆【纳L和產毒條件進行研究，明確尖孢鐮刀菌亞麻?；圆【L和產毒的最適培養(yǎng)條件，為今后亞麻枯萎病的防治和利用毒素篩選亞麻枯萎病抗病品種奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試菌株:黑龍江省蘭西縣亞麻田采集、分離、純化的尖孢鐮刀菌亞麻專化型強致病菌株(編號F4)。

1.2 試驗方法

1.2.1 粗毒素濾液的制備

將F4菌株移接在PSA平板培養(yǎng)基上，于25℃下培養(yǎng)7天，沿菌落邊緣打出直徑6 mm菌片，接入裝有150ml Richard培養(yǎng)液的250ml三角瓶內，每瓶接6片，置于30℃黑暗條件下，120r/min連續(xù)振蕩培養(yǎng)15天。培養(yǎng)液過濾(先用4層紗布，再用2層濾紙)，濾液離心30 min(3000 r/min)，棄去沉淀，上清液煮沸15min，濾液保存在4℃冰箱內，供測備用。

1.2.2 胚根生長抑制率的測定方法

參照陸仕華 (1985)抑制胚根生長測定法[7]。將供試的亞麻種子用漂白粉溶液 (1:14)浸種3min，進行表面消毒。用無菌水沖洗3遍后放入鋪有濾紙的培養(yǎng)皿中，加入亞麻尖孢鐮刀菌毒素濾液15ml，25℃黑暗下培養(yǎng)，5天后測定并計算胚根生長抑制率。每個培養(yǎng)皿中放50粒種子，設3次重復，對照用等量清水處理。

胚根生長抑制率 (%)=(對照胚根生長長度－處理胚根生長長度)÷對照胚根生長長度×100

1.2.3 培養(yǎng)液的選擇

將供試F4菌株在PSA培養(yǎng)基25℃下培養(yǎng)7天，沿菌落邊緣打出6mm菌片，接種盛有150ml培養(yǎng)液的250ml三角瓶內，每瓶接6片，25℃培養(yǎng)15天，統(tǒng)計菌絲干重、孢子濃度和亞麻胚根生長抑制率。

(1)改良Czapek培養(yǎng)液:硝酸鈉2g，硫酸亞鐵2.5g，磷酸二氫鉀1g，蔗糖30g，硫酸鎂0.01 g，氯化鉀0.5g，蒸餾水1000ml。

(2)Fries培養(yǎng)液:硫酸鎂0.5g，蔗糖20g，酒石酸5g，硝酸1g，磷酸二氫鉀1g，氯化鈉0.1g，氯化鈣0.13g，酵母浸膏1g，蒸餾水1000ml。

(3)Richard培養(yǎng)基:硝酸鉀19g，氧化鐵0.01g，磷酸二氫鉀5g，蔗糖5g，硫酸鎂0.5g，蒸餾水1000ml。

(4)Armstrong鐮刀菌培養(yǎng)基:磷酸二氫鉀1.1g，硫酸鎂0.4g，葡萄糖20g，氯化鉀1.6g，硝酸鈣5.9g，硫酸鋅0.2mg，三氯化鐵0.2mg，硫酸錳0.2mg，水1000ml。

(5)MS無機鹽+蔗糖培養(yǎng)液:MS無機鹽培養(yǎng)基+3%蔗糖，蒸餾水1000ml。

(6)PD培養(yǎng)液:馬鈴薯200g，葡萄糖20g，蒸餾水1000ml。

1.2.4 培養(yǎng)溫度對病菌生長和產毒的影響

選擇最適合產生毒素的培養(yǎng)液，接種病菌后，分別置于5℃，10℃，15℃，20℃，25℃，30℃，35℃7個溫度梯度處理下進行培養(yǎng)，培養(yǎng)15天，統(tǒng)計其菌絲干重、孢子濃度和對亞麻胚根的生長抑制率。

1.2.5 培養(yǎng)時間對病菌生長和產毒的影響

選擇最適合產生毒素的培養(yǎng)液，接種病菌后，在最適溫度下，分別培養(yǎng)10天、15天、20天、25天、30天、35天統(tǒng)計其菌絲干重、孢子濃度和對亞麻胚根的生長抑制率。

1.2.6 pH值對病菌生長和產毒的影響

PH值設3、4、5、6、7、8、9共7種處理。

1.2.7 光照條件對病菌生長和產毒的影響

24小時連續(xù)光照、12小時明暗交替、24小時連續(xù)黑暗，光照強度3000Lux。

2 結果與分析

2.1 培養(yǎng)液對病菌生長和產毒的影響

在6種不同培養(yǎng)液中亞麻尖孢鐮刀菌均能生長和產毒，但6種培養(yǎng)液的菌絲生長、產孢能力、產毒能力差異顯著，其中MS無機鹽+蔗糖培養(yǎng)液最利于菌絲生長，其菌絲干重顯著高于其他培養(yǎng)液，菌絲干重達到421mg/瓶，其次為改良Czapek培養(yǎng)液，其菌絲干重為386mg/瓶;Armstrong鐮刀菌培養(yǎng)液最有利于孢子生長，孢子濃度顯著高于其他培養(yǎng)液，為20.8×106個/ml，其次為改良Czapek培養(yǎng)液，孢子濃度為19.3×106個/ml;Richard培養(yǎng)液最有利于產毒，胚根的生長抑制率顯著高于其他培養(yǎng)液，胚根的生長抑制率為58.9%，其次為改良Czapek培養(yǎng)液，對亞麻胚根生長的抑制率為45.8%，結果見表1。

表1 不同培養(yǎng)液對亞麻尖孢鐮刀菌生長和產毒的影響Tab.1 Effect of different culture media on F.oxysporum growth and toxin production

2.2 培養(yǎng)溫度對病菌生長和產毒的影響

在6種培養(yǎng)溫度處理下菌絲生長差異顯著，其中25℃最有利于菌絲生長，菌絲干重顯著高于其他處理為，菌絲干重為384 mg/瓶;病菌在6種培養(yǎng)溫度下孢子生長差異顯著，其中25℃孢子濃度顯著高于其處理，孢子濃度為12.5×106個/ml;病菌在6種培養(yǎng)溫度處理下產毒能力差異顯著，30℃條件下最有利于產毒，產毒能力顯著高于其他處理，胚根生長抑制率達到64.4%，結果見表2。

2.3 培養(yǎng)時間對病菌生長和產毒的影響

在6種培養(yǎng)時間處理下菌絲生長差異顯著，在25天時菌絲干重顯著高于其他處理，菌絲干重為912mg/瓶;在6種培養(yǎng)時間處理下孢子濃度差異顯著，在25天時孢子濃度顯著高于其他處理，孢子濃度為19.6×106個/ml;在6種培養(yǎng)時間處理下病菌產毒能力差異顯著，在25天時病菌產毒能力顯著高于其他處理，對亞麻胚根生長抑制率達到75.6%，結果見表3。

表2 培養(yǎng)溫度對亞麻枯萎病病菌生長和產毒的影響Tab.2 Effect of temperature on F.oxysporum growth and toxin production

表3 培養(yǎng)時間對亞麻尖孢鐮刀菌生長和產毒的影響Tab.3 Effect of culture time on F.oxysporum growth and toxin production

2.4 pH值對病菌生長和產毒的影響

在7種處理條件下病菌菌絲生長、孢子濃度和產毒能力都差異顯著，總體來看病菌在PH 6～7之間生長較好，最適PH值為7，在PH7時菌絲干重、孢子濃度和病菌產毒能力都顯著高于其他處理。隨著PH值的升高亞麻枯萎病病菌產毒能力升高，但增長速度緩慢，PH7時亞麻胚根生長抑制率達到最高為65.8%，之后隨PH值升高，胚根生長抑制率下降，結果見表4。

表4 PH對亞麻尖孢鐮刀菌生長和產毒的影響Tab.4 Effect of pH on F.oxysporum growth and toxin production

2.5 光照條件對病菌生長和產毒的影響

24小時連續(xù)黑暗條件下菌絲干重顯著高于其他2種處理，為389 mg/瓶;24小時連續(xù)黑暗條件下孢子濃度顯著高于其他2種處理，孢子濃度高為12.3×106個/ml;24小時連續(xù)光照條件下產毒能力顯著高于其他2種處理，亞麻胚根生長抑制率達到64.3%，結果見表5。

表5 光照條件對亞麻枯萎病病菌生長和產毒的影響Tab.5 Effect of light treatment on F.oxysporum growth and toxin production

3 結論與討論

3.1 亞麻枯萎病病原菌最適生長培養(yǎng)條件

MS無機鹽+蔗糖培養(yǎng)液最適合病菌菌絲的生長，Armstrong鐮刀菌培養(yǎng)液最適合病菌孢子的生長，病菌最適生長的溫度為25℃，最適培養(yǎng)時間為25～30天，最適PH值為7，最適24小時連續(xù)黑暗下生長。

3.2 亞麻枯萎病病菌最適產毒培養(yǎng)條件

Richard培養(yǎng)液最適病菌產毒，病菌產毒最適的溫度為30℃，最適培養(yǎng)時間為25天，最適PH值為7，最適24小時連續(xù)光照生長。

3.3 討論

從研究結果來看在同一培養(yǎng)條件下隨著菌絲生長，菌株產毒能力增強，但孢子濃度的多少與菌株產毒能力無必然聯(lián)系，當孢子濃度升高到一定程度時，菌株產毒能力反而下降，這可能是孢子與毒素間競爭營養(yǎng)成分造成的，這與馬國斌 (1996)[8]的研究結果一致。

本文僅對亞麻枯萎病病菌生長和產毒條件進行了研究，明確亞麻枯萎病病菌生長和產毒的最適培養(yǎng)條件，在今后的工作中還需對亞麻枯萎病病菌產生鐮刀菌酸的規(guī)律進行繼續(xù)研究探索，為亞麻枯萎病的高效防治和利用亞麻枯萎病粗毒素篩選亞麻枯萎病抗病品種奠定基礎。

[1]楊學，王玉富，關鳳芝，等.亞麻枯萎病發(fā)生特點及防治[J].黑龍江農業(yè)科學，2002，24(1):23－26.

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