萬春平 唐彥 何平

摘要：目的觀察龍牡桂枝湯對注意缺陷多動障礙（ ADHD）模型動物一幼年自發(fā)性高血壓大鼠（SHR）左右額葉一紋狀體去甲腎上腺素轉運體（ NET）蛋白表達的影響，探討該藥治療ADHD的作用機制。方法采用幼年雄性SHR大鼠48只，隨機分為龍牡桂枝湯高、中劑量組、鹽酸哌甲酯對照組和生理鹽水對照組，連續(xù)灌胃給藥14天，采用Western-blot法檢測各組大鼠左右腦前額葉皮質、紋狀體NET蛋白表達水平。結果用藥后，鹽酸哌甲酯對照組、龍牡桂枝湯中、高劑量組大鼠右腦前額葉皮質和紋狀體的NET蛋白表達增加，而各實驗組大鼠左腦前額葉皮質和紋狀體NET蛋白表達無明顯變化。結論龍牡桂枝湯治療ADHD的作用機制之一與其能上調右腦前額葉皮質、紋狀體的NET蛋白表達有關。

關鍵詞：龍牡桂枝湯；ADHD模型大鼠；左右腦；NET

中圖分類號：R285.5

文獻標志碼：A

文章編號：1007-2349（2015）03-0018-04

兒童多動癥又稱注意缺陷多動障礙（attention -deficit/hyperactivity disorder，ADHD），是兒童期最常見的行為問題，主要表現(xiàn)為注意力不集中、多動和沖動等癥狀。大量研究表明本病病理機制復雜，是多基因作用下的遺傳性疾病，以鹽酸哌甲酯為代表的中樞興奮劑兇遠期療效欠佳及藥物的不良反應，使其臨床應用受到一定限制。中醫(yī)學通過整體辨證，施行個體化治療取得較好療效。龍牡桂枝湯是云南省名中醫(yī)，全國第三、五批老中醫(yī)學術經驗繼承指導老師劉以敏主任治療多動癥的經驗方，尤其能提高患兒的注意力[1]，前期動物實驗顯示龍牡桂枝湯可減少ADHD模型大鼠SHR的白發(fā)活動水平，提高非選擇性注意力[2]，為深入探索其作用機制，本實驗采用最常用的ADHD動物模型一白發(fā)性高血壓大鼠（SHR），研究龍牡桂枝湯對左右腦前額葉皮質一紋狀體去甲腎上腺素轉運體（NET）蛋白表達的影響，現(xiàn)將結果報道如下。1 材料與方法1.1 實驗動物SHR（鼠齡5周），雄性，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司。飼養(yǎng)于清潔級環(huán)境中，動物自由飲食進水。1.2儀器和試劑紅外熒光成像掃描系統(tǒng)（Gene公司，型號：Odyssey CLX），超微量核酸蛋白檢測儀（美國Thermo，型號：NanoDrop2000）。

RIPA蛋白提取試劑盒（碧云天）；BCA蛋白定量測定試劑盒（碧云天）；SDS - PAGE蛋白上樣緩沖液（碧云天）；二抗羊抗兔（IRDye 800cw，Li-Cor）；內參GADPH（Cell Signaling）；抗大鼠NET抗體（Santa Cruz Biotechnology）。1.3藥物及制備 復方由桂枝、白芍、生龍骨、生牡蠣、石菖蒲、炙遠志、浮小麥、小棗、炙甘草組成，由云南中醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院門診部藥房提供，制成水煎劑后，按高、中劑量給藥，配成含生藥1.8g/mL、0.9g/mL的溶液并充分攪勻，用量分別為18g/kg，9g/kg貯于4℃冰箱備用；鹽酸哌甲酯控釋片（美國ALZA公司生產，產品批號ODA3915），每次灌胃時當場配制，使藥物濃度為0. 375mg/mL，用量為3.75 mg/kg。1.4分組及給藥48只雄性SHR大鼠飼養(yǎng)于清潔級環(huán)境中，平衡1周后，隨機分為生理鹽水對照組（空白組）、鹽酸哌甲酯對照組（對照組）、龍牡桂枝湯中劑量組和龍牡桂枝湯高劑量組4組，根據大鼠蓖警，均按1mL/100g用量灌胃。每日給藥1次，共14d1.5樣品標本采集 各組大鼠于灌胃14天后斷頭處死，在冰臺上迅速分離左右大腦的前額葉皮質和紋狀體，速凍后轉移至- 80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?.6

Western-blot法檢測標本中NET的蛋白表達稱取100 mg腦組織，加入300uL RIPA細胞裂解液，勻漿器將組織勻漿，冰上裂解30min，12000 r/min離心10 min，BCA蛋白定量試劑凋成統(tǒng)一濃度，加入SDS上樣緩沖液，煮沸10min后，上樣于10%聚丙烯酰胺凝膠，在Tris -甘氨酸電泳緩沖液中以60～80V電壓電泳約2h，用濕轉法將蛋白從凝膠轉移至硝酸纖維素膜，剪取目的條帶后，加入含5%BSA的洗液，置于搖床室溫封閉1～2h；然后加入特異性一抗丁4℃雜交過夜，洗膜后；再加入熒光標記的二抗，室溫溫育1h，洗膜，然后在紅外熒光成像掃描系統(tǒng)800 nm通道掃描成像。以目的蛋白與β-actin蛋白表達量的比值作為該蛋白的相對表達水平。2結果2.1 左右腦前額葉皮質NET蛋白的表達（圖1）在右腦前額葉皮質，鹽酸哌甲酯對照組、復方中劑量組、高劑量組的NET蛋白表達較生理鹽水組增加，而左腦各實驗組大鼠前額葉皮質的NET蛋白表達無顯著差異。2.2左右腦紋狀體NET蛋白的表達（圖2） 在右腦紋狀體，鹽酸哌甲酯對照組、復方中劑量組、高劑量組的NET蛋白表達較生理鹽水組增加，左腦各實驗組大鼠紋狀體的NET蛋白表達無顯著差異。3討論

國內外大量神經影像學研究證實：額葉一紋狀體通路異常在ADHD的病理生理機制中起重要作用，是ADHD發(fā)病機制的權威學說[3]。雖然腦內多巴胺（ DA）對額葉一紋狀體通路的調控非常重要，但去甲腎上腺（ NE）系統(tǒng)的功能失調很早就被提出是ADHD的致病因素之一[4]，并成為近年來的研究熱點。NE能系統(tǒng)與視覺注意的增強、適應行為的啟動、學習及記憶有關，其對持續(xù)注意缺陷有著更重要的影響。NET是將突觸間隙的去甲腎上腺素重攝取到突觸前神經末梢的可溶性載體蛋白，對維持受體對神經遞質的敏感性極為重要，研究發(fā)現(xiàn)在前額葉皮層，NE可以通過NET間接調節(jié)DA釋放，而DA不能調節(jié)NE釋放[5]。國內學者錢秋謹研究發(fā)現(xiàn)，在漢族人群中NET1基因可能是單純ADHD，尤其是注意缺陷為主型ADHD的易感基因[6]。多項分子影像學研究證據提示[7]：ADHD腦受損以右腦更為明顯；右額葉一紋狀體區(qū)可能為ADHD神經解剖學基礎，右額前皮質區(qū)血流灌注和功能異常是ADHD病理生理基礎。

龍牡桂枝湯由桂枝、白芍、龍骨、牡蠣、浮小麥、小棗、石菖蒲、遠志、炙甘草組成。方中桂枝，白芍相須為用，收斂浮越陽氣；龍骨、牡蠣潛陽安神；浮小麥養(yǎng)心除煩，小棗益氣養(yǎng)血安神；基于“怪病頑癥多有痰作祟”的理論，龍骨、牡蠣能降逆化痰；石菖蒲豁痰開竅；遠志清心化痰，均可化無形之痰，以“開心竅，通神明”，炙甘草調和諸藥，以上九藥合用，潛陽入陰，交通心腎，開竅寧神，蘊涵了升降互補、剛柔相濟、相反相成的配伍思想，有“調和陰陽”之妙，尤其能有效改善多動癥患兒的注意力，基于NET與注意缺陷確有關聯(lián)，因此本研究焦距于NET，旨在觀察龍牡桂枝湯提高注意力是否與影響NET有關。

從目前文獻報道看，在分子生物學水平研究復方治療ADHD的作用機制，多集中于DA系統(tǒng)，尚無涉及NE系統(tǒng)的報道。本實驗結果顯示：在灌服鹽酸哌甲酯和龍牡桂枝湯后，與生理鹽水比較，ADHD模型大鼠右腦前額葉皮質和紋狀體的NET表達增加，但左腦前額葉皮質和紋狀體NET的變化并不明顯，提示鹽酸哌甲酯和龍牡桂枝湯治療ADHD的作用機制，與上調右腦前額葉皮質和紋狀體NET的表達有關。這也證實了龍牡桂枝湯在臨床上改善患兒的注意力，與其能直接作用于ADHD的病位一右腦額葉一紋狀體區(qū)，并影響與注意力密切相關的NET表達有關，有可能通過上調右腦前額葉皮質和紋狀體的NET表達后，既調控了NE的重攝取，又間接影響了DA的釋放，從而對維持腦內神經遞質的平衡以揮一定的作用。由于ADHD發(fā)病的神經生化機制異常復雜，龍牡桂枝湯如何作用相關腦區(qū)的其他神經遞質，以及不同功效的復方對NET的影響有何差異，都有待進一步研究。參考文獻：[1]何平，朱瑛.劉以敏老師辨證治療兒童多動癥經驗初探[J].云南中醫(yī)中藥雜志，2006，27（1）：5.[2]何平，唐彥，楊若俊，龍牡桂枝湯改善注意缺陷多動障礙大鼠行為的實驗研究[J].中國中西醫(yī)結合兒科學，2014，6（6）：203 -205[3]薛紅麗，靜進注意缺陷多動障礙神經心理缺損的研究進展[J].國外醫(yī)學.婦幼保健分冊，2004，16（2）：65-67.[4] Arnsten AF，Steere，JC，Hunt RD. The contribution of alpha 2-nora-drenergic mechanisms of prefrontal cortical cognitive function. Potentialsignificance for attenlion - deficit hyperactivity disorder[J]. Arch GenPsychiaty，1996 ，53（5）：448-455.[5] Bymaster FP，Kater JS，Nelson DJ，et al Atomotime increases extracel-luler levels of norepinephrine and dopamine in prefrontal cortex of rat：apotential mechanism for efficacy in aUention deficit/hyperactivity disor-der[J].Neuropsychopharmacology. 2002 ，27（5）：699 -711.[6]王藝，劉璐，錢秋謹，等.去甲腎上腺素轉運體基因與單純注意缺陷多動障礙的關聯(lián)研究[J].中國心理衛(wèi)生雜志，2014，28（2）：114-119.[7]張嘉輝，趙正勤，賈少微.注意力缺陷多動障礙分子影像學進展[J].中國醫(yī)學創(chuàng)新，2012，9（31）：159-160.

（收稿日期：2014-10-05）