蘇南　蘇小俊　蔣芳玲　吳震　畢云飛　劉勛

摘要：以耐熱甘藍品種啟夏和不耐熱甘藍品種蘇甘25號為試材， 研究表油菜素內(nèi)酯處理對高溫脅迫下甘藍幼苗耐熱性相關生理指標的影響。結果表明，高溫脅迫下，表油菜素內(nèi)酯增加了超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、過氧化物酶（POD）、抗壞血酸過氧化物酶（APX）的活性，緩解了高溫脅迫下MDA和H2O2的積累，增強了甘藍抗氧化能力，提高了滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)脯氨酸和可溶性蛋白含量，有效緩解了高溫脅迫對甘藍幼苗的影響，其中以 0.5 mg/L 表油菜素內(nèi)酯處理效果較顯著。這表明，表油菜素內(nèi)酯有利于降低高溫脅迫對甘藍幼苗的抑制作用。

關鍵詞：表油菜素內(nèi)酯；甘藍；高溫脅迫；耐熱性；生長指標；生理指標

中圖分類號： S635.101 文獻標志碼： A 文章編號：1002-1302（2015）07-0137-05

結球甘藍（Brassica oleracea var. capitata）是十字花科蕓薹屬一種重要蔬菜，在中國種植廣泛。高溫是蔬菜生產(chǎn)中最常見的逆境因子，嚴重影響蔬菜的產(chǎn)量和品質(zhì)。秋甘藍播種一般在6—7月，幼苗期正值夏季高溫，熱脅迫會使甘藍幼苗的生理代謝紊亂，生長受到抑制或造成徒長，育成的秧苗質(zhì)量差，抗逆性弱，嚴重影響后期產(chǎn)量和品質(zhì)[1]。因此，增強甘藍幼苗的耐熱性是生產(chǎn)中亟待解決的問題。油菜素內(nèi)酯（brassinolide，簡稱BR）是一種新型植物生長調(diào)節(jié)劑，被稱為第六大類植物激素， 在植物體內(nèi)含量極低，但生理活性卻極高，經(jīng)極低質(zhì)量濃度處理便能表現(xiàn)出明顯的生理效應。研究結果表明，油菜素內(nèi)酯可調(diào)節(jié)植物本身所需要的多種酶、激素，提高植物對許多脅迫，如水分、鹽分及病害等的抗性[2-3]。人工合成的高活性油菜素內(nèi)酯類似物為表油菜素內(nèi)酯（24-epibrassinolide， 簡稱EBR）在生產(chǎn)上已廣泛應用[4]。在抗高溫方面，表油菜素內(nèi)酯有利于甜瓜幼苗在高溫脅迫下抗氧化酶活性的維持和對光能的捕獲與轉(zhuǎn)換，有效促進脯氨酸（Pro）的積累，Pro作為膜的穩(wěn)定劑，增強了植物對不良環(huán)境的抵抗力，促進生長[5]。朱誠等報道，黃瓜種子用0.01～1 mg/L表油菜素內(nèi)酯浸種24 h，能提高幼苗對熱激（ 48 ℃， 90 min）的忍耐性[6]。康云艷等研究表明表油菜素內(nèi)酯能促進低氧脅迫下黃瓜根系中抗氧化酶活性和 AsA、GSH 含量，降低 ROS 含量，增強黃瓜抗低氧脅迫的能力[7]；但有關表油菜素內(nèi)酯對提高甘藍耐熱性的研究還未見報道。本試驗以甘藍品種啟夏和蘇甘25號為材料，研究高溫脅迫下表油菜素內(nèi)酯對甘藍幼苗的生理調(diào)節(jié)效應及其機制。

1 材料與方法

1.1 材料

供試甘藍品種為耐熱品種啟夏和不耐熱品種蘇甘25號。由江蘇省農(nóng)業(yè)科學院提供。試驗于2014年7月15日在南京農(nóng)業(yè)大學園藝學院網(wǎng)室內(nèi)進行。種子催芽后播種于72孔穴盤，育苗基質(zhì)為泥炭 ∶蛭石 ∶珍珠巖=2 ∶1 ∶1的混合基質(zhì)， 萌發(fā)后每隔3 d澆1次營養(yǎng)液，育苗期平均溫度為25 ℃，按常規(guī)方法進行統(tǒng)一管理，甘藍2葉1心時進行表油菜素內(nèi)酯和高溫處理。

表油菜素內(nèi)酯溶液設0（CK，噴施清水處理）、0.25、0.5 mg/L 3個質(zhì)量濃度，幼苗3葉1心時，連續(xù) 4 d 噴施至葉面滴水，處理完后，放進光照培養(yǎng)箱進行高溫脅迫處理，高溫處理為42 ℃ 12h 光照/30 ℃ 12 h 黑暗，對照為22 ℃ 12h 光照/15 ℃ 12 h 黑暗，光照度為30 000 lx，處理 2 d 后，進行各項指標測定。

1.2 方法

1.2.1 生長指標測定 高溫處理后，在每個處理穴盤中隨機選取3株植株，測定其株高、根長、鮮質(zhì)量。

1.2.2 生理生化指標測定 稱取0.2 g各處理的幼苗葉片，置于預冷的研缽中，加入50 mmol/L、 pH值 7.8的磷酸緩沖液（PBS）5 mL 在冰浴中研磨提取，在4 ℃ 離心機中 9 000 r/min 離心20 min，取上清液定容至10 mL，上清液為酶提取液，用于超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、過氧化物酶（POD）和抗壞血酸過氧化物酶（APX）測定。SOD 活性測定采用氮藍四唑法[8]，CAT活性測定采用高錳酸鉀滴定法[9]，POD活性測定采用愈創(chuàng)木酚法[9]，APX活性測定采用Nakano等的方法[10]。丙二醛（MDA）含量測定采用 TCA -TBA 法[8]，游離脯氨酸含量測定參照李合生等的方法[8]。過氧化氫（H2O2）含量的測定用碘化鉀分光光度法[11]?？扇苄缘鞍缀繙y定采用考馬斯亮藍G-250染色法[12-13]。葉綠素含量測定采用光譜吸收法[14]。以上生理指標測定均設置3次重復。

1.2.3 數(shù)據(jù)處理 采用Origin軟件進行繪圖， 用SPSS統(tǒng)計軟件對平均數(shù)用t測驗和Duncans新復極差法進行比較分析。

2 結果與分析

2.1 外源表油菜素內(nèi)酯可促進甘藍幼苗在常溫和高溫下的生長

由表1、表2可以看出，在常溫下，表油菜素內(nèi)酯對2個甘藍品種幼苗生長均有促進作用，高溫脅迫下，甘藍幼苗生長明顯變?nèi)酰啾扔谖磭娛┍碛筒怂貎?nèi)酯的高溫處理，表油菜素內(nèi)酯處理增加了幼苗根長、株高、鮮質(zhì)量，說明表油菜素內(nèi)酯能緩解高溫脅迫，對幼苗生長有促進作用，其中，在表油菜素內(nèi)酯質(zhì)量濃度為0.5 mg/L時，能顯著提高甘藍幼苗對高溫脅迫的耐受性。

2.2 外源表油菜素內(nèi)酯對高溫脅迫下甘藍幼苗生理指標的影響

2.2.1 外源表油菜素內(nèi)酯對高溫脅迫下甘藍幼苗葉片MDA含量和H2O2含量的影響 由圖1可知，與常溫處理相比，高溫脅迫下，甘藍幼苗的MDA含量均顯著升高，但無論是常溫

處理還是高溫脅迫下，經(jīng)表油菜素內(nèi)酯處理的甘藍MDA含量均顯著低于未經(jīng)表油菜素內(nèi)酯處理的對照。且表油菜素內(nèi)酯質(zhì)量濃度為0.5 mg/L處理的甘藍幼苗葉片的MDA含量最低，其中啟夏為6.59 μmol/g，蘇甘25號為6.56 μmol/g，與噴清水的對照相比，啟夏和蘇甘25號分別降低了26.6% 和22.9%，這說明外施適宜質(zhì)量濃度表油菜素內(nèi)酯有效緩解了高溫對甘藍幼苗葉片膜的膜脂過氧化作用。低質(zhì)量濃度的H2O2 是一種信號物質(zhì)，高質(zhì)量濃度的H2O2是一種傷害物質(zhì)[15]，由圖2可知，常溫下，表油菜素內(nèi)酯處理可誘導幼苗葉片中H2O2含量升高，與清水處理相比，0.5 mg/L 表油菜素內(nèi)酯處理顯著提高了甘藍幼苗H2O2含量，但均低于高溫脅迫下H2O2的質(zhì)量濃度。而高溫脅迫處理后，2個品種的甘藍幼苗葉片的H2O2含量均顯著高于常溫處理，表油菜素內(nèi)酯處理可顯著降低葉片中H2O2的含量（除蘇甘25號0.5 mg/L表油菜素內(nèi)酯處理），表油菜素內(nèi)酯質(zhì)量濃度為0.5 mg/L時效果較為明顯。與噴清水的對照相比，啟夏和蘇甘25號H2O2含量分別降低了22.7% 和12.3%。不管是常溫還是高溫處理，蘇甘25號H2O2含量整體低于啟夏甘藍。endprint

2.2.2 外源表油菜素內(nèi)酯對高溫脅迫下甘藍幼苗抗氧化酶活性的影響 由圖3、圖4、圖5、圖6可看出，與對照相比，高溫脅迫后，除啟夏以0.25 mg/L表油菜素內(nèi)酯處理的POD活性和蘇甘25號以0.25 mg/L表油菜素內(nèi)酯處理的CAT活性沒有顯著提高外，其他處理的SOD、POD、CAT、APX活性均顯著高于對照，以表油菜素內(nèi)酯0.5 mg/L處理效果最佳，啟夏和蘇甘25號分別比對照提高18.3% 和5.7%、68.8%和616%、17.1%和13.8%、252%和52.4%。總體來說，無論是常溫還是高溫，表油菜素內(nèi)酯0.5 mg/L處理酶活性>0.25 mg/L 處理酶活性>CK處理酶活性。其中由圖3可知，常溫下，啟夏以0.25 mg/L表油菜素內(nèi)酯處理與對照差異不顯著，但與噴清水的對照相比，SOD活性提高了6.0%，蘇甘25號以0.5 mg/L和0.25 mg/L表油菜素內(nèi)酯處理間效果差異不顯著，但SOD活性均大于對照，分別提高5.7% 和46%。由圖5可看出，常溫下，啟夏以0.25 mg/L處理的CAT活性相比對照沒有顯著提高，蘇甘25號經(jīng)表油菜素內(nèi)酯處理的2個質(zhì)量濃度間沒有顯著性差異。并且在所有氧化酶活性指標中，2個品種同一處理組常溫和高溫差異均顯著，有些還為極顯著。啟夏和蘇甘25號間差異也為顯著。

2.2.3 表油菜素內(nèi)酯對高溫脅迫下甘藍幼苗脯氨酸和可溶性蛋白含量的影響 脯氨酸是最重要和有效的有機滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，幾乎所有的逆境，如干旱、高溫、低溫、冰凍、鹽漬、低pH值、營養(yǎng)不良、病害、大氣污染等都會造成植物體內(nèi)脯氨酸的累積。脯氨酸作為一種膜的穩(wěn)定劑，能保持細胞膜結構的完整性。因此，在高溫脅迫下，脯氨酸含量的高低可以作為植物對高溫逆境抵抗強弱的一個生理鑒定指標[16]。由圖7可看出，高溫脅迫后，幼苗葉片的脯氨酸含量升高，經(jīng)表油菜素內(nèi)酯處理的脯氨酸含量比對照的脯氨酸含量要高，且差異顯著，其中表油菜素內(nèi)酯質(zhì)量濃度為0.5 mg/L的效果最為顯著，啟夏和蘇甘25號分別比對照提高16.8%和11.4%。但啟夏在常溫下，以0.25 mg/L表油菜素內(nèi)酯處理的Pro含量提高不顯著，高溫脅迫后，經(jīng)表油菜素內(nèi)酯處理的2個濃度間差異不明顯。2個品種間同一處理組常溫和高溫差異均極顯著?！?/p>

可溶性蛋白含量的提高可以增加細胞的滲透勢和功能蛋白（如熱激蛋白）的數(shù)量，有助于維持細胞正常的代謝，提高植物的抗逆性[4]。由圖8可知，高溫脅迫后，啟夏幼苗葉片的可溶性蛋白含量升高，其升高趨勢大于蘇甘25號的升高趨勢，且經(jīng)表油菜素內(nèi)酯處理的可溶性蛋白含量均顯著高于對照，其中以質(zhì)量濃度為0.5 mg/L的處理效果更顯著，為 5.18 mg/g，較對照提高16.5%。無論是在常溫還是在高溫下，品種蘇甘25號在表油菜素內(nèi)酯濃度為0.25 mg/L時可溶性蛋白含量升高均不顯著，而在表油菜素內(nèi)酯濃度為 0.5 mg/L 時升高顯著，為4.72 mg/L，較對照提高12.2%。

2.2.4 表油菜素內(nèi)酯對高溫脅迫下甘藍幼苗葉綠素的影響 葉綠素是光合作用不可缺少的重要物質(zhì)，因而有的學者曾嘗試以測定高溫脅迫下葉綠素含量的變化來鑒定作物抗熱性，但羅少波等[17]、楊麗薇等[18]、馬德華等[19]對大白菜和黃瓜的研究表明，葉綠素含量變化沒有一定的規(guī)律性，或與溫度逆境的抗性無明顯的相關性，因此認為葉綠素含量變化率不能作為耐熱性的一個生理指標。本試驗通過對葉綠素含量的測定來確定表油菜素內(nèi)酯處理能否提高甘藍幼苗對高溫的抵抗能力，結果發(fā)現(xiàn)各個不同質(zhì)量濃度處理后在高溫脅迫下，甘藍幼苗葉片中葉綠素含量的變化沒有一定的規(guī)律性，所以認為葉綠素含量測定不能作為表油菜素內(nèi)酯誘導甘藍抗熱性的一個生理指標。

3 結論與討論

油菜素內(nèi)酯是一種新型植物激素， 在植物體內(nèi)含量極低，但生理活性卻極高，人們對表油菜素內(nèi)酯生理作用的研究越來越重視。研究表明油菜素內(nèi)酯可通過增強植物體內(nèi)抗氧化酶活性和增加植物體內(nèi)抗氧化物質(zhì)含量來提高植物抗逆境的能力[20]。本試驗表明，高溫脅迫后甘藍幼苗株高、根長和鮮質(zhì)量均顯著低于對照，外源表油菜素內(nèi)酯可以有效緩解高溫脅迫對甘藍幼苗生長的抑制作用（表1、表2）。

植物處于逆境條件下活性氧物質(zhì)會升高，低質(zhì)量濃度的H2O2 是一種信號物質(zhì)，高質(zhì)量濃度的H2O2是一種傷害物質(zhì)[15]。細胞中MDA是膜脂過氧化作用的主要產(chǎn)物，其含量的多少可表示植物細胞膜受傷害程度的大小。本試驗中，常溫下表油菜素內(nèi)酯處理提高了H2O2質(zhì)量濃度，可能是作為一種信號物質(zhì)增強植物抗性。與常溫處理相比，高溫脅迫下H2O2含量顯著升高，表油菜素內(nèi)酯處理有效降低了葉片MDA和H2O2含量的積累，抑制膜脂過氧化，緩解了高溫脅迫對植株的傷害。

在生物膜脂過氧化酶促防御體系中，SOD、PDO、CAT、APX 等均是重要的膜保護酶類。在本試驗中，高溫脅迫后，抗氧化酶活性顯著降低，但經(jīng)表油菜素內(nèi)酯處理的甘藍幼苗葉片的抗氧化酶活性顯著高于對照，說明表油菜素內(nèi)酯能有效緩解高溫脅迫對甘藍幼苗葉片的抗氧化酶活性的影響，其中表油菜素內(nèi)酯以質(zhì)量濃度0.5 mg/L處理效果更佳，2個品種中，除APX酶活性外，啟夏酶活性均高于蘇甘25號，可能2個品種活性氧清除系統(tǒng)存在一定差異。

高溫脅迫條件下，植物會主動積累可溶性蛋白和脯氨酸，抵抗熱脅迫的傷害[21-22]。本研究中，高溫脅迫后，葉片的可溶性蛋白和脯氨酸含量顯著提高，表油菜素內(nèi)酯處理可進一步提高脯氨酸和可溶性蛋白的積累 （圖7、圖8）。以上結果說明了表油菜素內(nèi)酯處理可通過增加滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的積累來提高甘藍植株的滲透調(diào)節(jié)能力，從而有利于提高機體對高溫傷害的抵抗能力。前人研究表明可溶性蛋白含量的提高可以增加細胞的滲透勢、功能蛋白（如熱激蛋白）的數(shù)量、維持細胞或組織持水能力，有助于維持細胞正常的代謝，提高植物的抗逆性[4]。2個品種均以表油菜素內(nèi)酯處理質(zhì)量濃度為 0.5 mg/L 最佳。endprint

對葉綠素含量的研究表明，葉綠素含量的變化沒有一定的規(guī)律性，所以認為葉綠素含量測定不能作為表油菜素內(nèi)酯誘導甘藍抗熱性的一個生理指標。

綜上所述，表油菜素內(nèi)酯處理顯著緩解了高溫脅迫下對甘藍幼苗的傷害，一定程度上促進了甘藍幼苗的生長，以質(zhì)量濃度為0.5 mg/L的噴施效果最佳，提高了抗氧化酶SOD、POD、CAT和APX活性，降低了MDA和H2O2含量，增加了脯氨酸和可溶性蛋白含量，從而增強植株抗高溫脅迫的能力。而就2個品種來比較，啟夏的SOD、POD、CAT酶活性、H2O2和脯氨酸含量高于蘇甘25號，MDA含量和APX酶活性則低于蘇甘25號，但不能由此推斷啟夏比蘇甘25號更耐熱。甘藍耐熱性的復雜表現(xiàn)受品種多種生理特性的綜合影響，具有較為復雜的數(shù)量性狀遺傳傾向[23]，還需進一步研究。萬正林研究認為0.5 mg/L表油菜素內(nèi)酯處理番茄效果最佳，抗高溫脅迫能力最強[16]；朱誠等發(fā)現(xiàn)外施0.01～1 mg/L表油菜素內(nèi)酯能提高黃瓜幼苗對熱激的忍耐性[6]；耶興元等發(fā)現(xiàn)0.3 mg/L表油菜素內(nèi)酯能提高獼猴桃耐熱性[20]；吳雪霞等用0.05 mg/L表油菜素內(nèi)酯噴施增強了茄子抗高溫脅迫的能力[4]。說明不同作物適宜的表油菜素內(nèi)酯質(zhì)量濃度不同。本研究中表油菜素內(nèi)酯處理甘藍幼苗以質(zhì)量濃度0.5 mg/L為最佳，可顯著提高甘藍幼苗耐高溫的能力，但可能會有更適合的質(zhì)量濃度，需要進一步研究。

參考文獻：

[1]陳碧華. 溫度處理對甘藍幼苗耐熱性的影響研究[D]. 重慶：西南農(nóng)業(yè)大學，2004：1-63.

[2]Steber C M，Mccourt P. A role for brassinosteroids in germination in Arabidopsis[J]. Plant Physiology， 2001， 125（2）： 763-769.

[3]紀秀娥，史留功，胡春紅，等. 油菜素內(nèi)酯對小麥、玉米種子萌發(fā)的影響[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學，2014，42（9）：88-89.

[4]吳雪霞，查丁石，朱宗文，等. 外源24-表油菜素內(nèi)酯對高溫脅迫下茄子幼苗生長和抗氧化系統(tǒng)的影響[J]. 植物生理學報，2013，49（9）：929-934.

[5]張永平，陳幼源，楊少軍. 高溫脅迫下24-表油菜素內(nèi)酯對甜瓜幼苗生理及光合特性的影響[J]. 植物生理學報，2012，48（7）：683-688.

[6]朱 誠，曾廣文，劉非燕. 表油菜素內(nèi)脂對黃瓜幼苗熱激忍耐和抗氧化代謝的關系[J]. 浙江農(nóng)業(yè)大學學報，1996，22（3）：66-70.

[7]康云艷，郭世榮，李 娟，等. 24-表油菜素內(nèi)酯對低氧脅迫下黃瓜幼苗根系抗氧化系統(tǒng)的影響[J]. 中國農(nóng)業(yè)科學，2008，41（1）：153-161.

[8]李合生，孫 群，趙世杰，等. 植物生理生化實驗原理和技術[M]. 北京：高等教育出版社，2000：123-258.

[9]徐朗萊，葉茂炳. 過氧化物酶活力連續(xù)記錄測定法[J]. 南京農(nóng)業(yè)大學學報，1989，12（3）：82-83.

[10]Nakano Y，Asada K. Hydrogen peroxide is scavenged by ascorbate specific peroxidase in spinach chloroplasts[J]. Plant and Cell Physiology，1981，22：867-880.

[11]Chakrabarty D，Datta S K. Micropropagation of gerbera： lipid peroxidation and antioxidant enzyme activities during acclimatization process[J]. Acta Physiologiae Plantarum，2008，30（3）：325-331.

[12]Arora R，Wisniewski M E. Cold acclimation in genetically related（sibling）deciduous and evergreen peach：A 60-kDa bark protein in cold-acclimated tissue of peach is heat-stable and related to the dehydrin family of proteins[J]. Plant Physiology，1994，105：95-101.

[13]Brady C J，Tung H F. Rate of protein synthesis in senescing，detached wheat leaves[J]. Australian Journal of Plant Physiology，1975，2：163-176.

[14]Arnon D L. Copper enzymes in isolated chloroplasts.polyphenol oxidase in Beta vulgaris[J]. Plant Physiology，1949，24：1-15.

[15]Mittler R，van Derauwera S，Suzuki N，et al. ROS signaling：the new wave[J]. Trends in Plant Science，2011，6：300-309.

[16]萬正林. 水楊酸、表油菜素內(nèi)酯誘導番茄幼苗抗高溫機理的研究[D]. 重慶：西南大學，2007：1-56.

[17]羅少波，李智軍，周微波，等. 大白菜品種耐熱性的鑒定方法[J]. 中國蔬菜，1996（2）：16-18.

[18]楊麗薇，王景義，梁惠芳，等. 早熟大白菜耐熱性鑒定技術[J]. 北方園藝，1996（6）：5-6.

[19]馬德華，龐金安，李淑菊，等. 溫度逆境鍛煉對高溫下黃瓜幼苗生理的影響[J]. 園藝學報，1998，25（4）：39-44.

[20]耶興元，仝勝利，張 燕. 油菜素內(nèi)酯對高溫脅迫下獼猴桃苗耐熱性相關生理指標的影響[J]. 西北農(nóng)業(yè)學報，2011，20（9）：113-116.

[21]何曉明，林毓娥，陳清華，等. 高溫對黃瓜幼苗生長、脯氨酸含量及SOD酶活性的影響[J]. 上海交通大學學報：農(nóng)業(yè)科學版，2002，20（1）：30-33.

[22]吳桂容，嚴重玲. 鎘對桐花樹幼苗生長及滲透調(diào)節(jié)的影響[J]. 生態(tài)環(huán)境，2006，15（5）：1003-1008.

[23]康俊根，翟依仁，張京社，等. 甘藍耐熱性鑒定方法[J]. 中國蔬菜，2002（1）：4-7.endprint