杭姣 陳亞利 陳可泉 韋萍

摘要：對未知菌種的鑒定是研究挖掘此菌種功能用途以及產(chǎn)物的基礎(chǔ)之一。根據(jù)形態(tài)學(xué)、生理生化鑒定以及26S rRNA的D1/D2區(qū)域的測序、5.8S rRNA-ITS的RFLP分析等對1株酵母菌進行了鑒定，并探究了其特殊的生長特性與產(chǎn)物。研究結(jié)果，該酵母菌被鑒定為圓形或者卵圓形，以出芽生殖為主，菌落為乳白色、圓形、凸起、邊緣光滑的淺白隱球酵母；經(jīng)過研究還發(fā)現(xiàn)，該酵母菌能在較大的pH值范圍（pH值3～13）內(nèi)生長，能在比較高的溫度（39 ℃）以及強酸強堿下生長，檢測到其產(chǎn)物為多糖，與以往淺白隱球酵母的產(chǎn)物有區(qū)別。

關(guān)鍵詞：耐輻射；酵母菌；鑒定；核糖體序列分析

中圖分類號： TQ920.1 文獻標(biāo)志碼： A 文章編號：1002-1302（2015）07-0320-05

傳統(tǒng)的也是權(quán)威的酵母菌鑒定方法是首先依據(jù)形態(tài)學(xué)特征和生理生化進行分析。20世紀(jì)90年代開始應(yīng)用的商業(yè)化Biolog系統(tǒng)[1-2]，即測試微生物在鑒定板各孔中對不同碳源的代謝能力進行菌種鑒定，這種鑒定也被稱為代謝指紋圖譜分析。但該方法對于那些并未得到很好分離純化的酵母菌，在特殊條件（如強輻射、光照、酸堿條件等）下產(chǎn)生變異的新菌種，其遺傳密碼和代謝途徑可能發(fā)生了變化有時也難以辨別。與傳統(tǒng)分類法互補的分子生物學(xué)方法研究酵母菌的基因型，主要以遺傳物質(zhì)核酸作為研究對象，更能反映其遺傳本質(zhì)，對酵母菌的多樣性分析能夠提供基因水平的詳細(xì)信息，使鑒定更具準(zhǔn)確性和遺傳特異性。目前，常用分子生物學(xué)鑒定酵母菌株的遺傳信息最直接檢測對象為：染色體基因組DNA、核糖體DNA、線粒體DNA，具體方法主要有基于聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）的酵母核糖體基因序列分析，例如26S rRNA的D1/D2區(qū)域基因序列測序，5.8S rRNA-ITS-RFLP分析等。本研究對于1株未知菌株從表型到代謝圖譜到基因型多種手段進行的鑒定，得出此菌株為淺白隱球酵母菌。由于其獨特的生長環(huán)境，該酵母菌各方面的特性都比較好，產(chǎn)物中有含量比較高的多糖，而多糖的存在可能是菌體對環(huán)境中普遍存在的抗菌物質(zhì)的反應(yīng)，如表面活性物質(zhì)、細(xì)菌毒素、噬菌體、抗生素、抗體等，所以野生菌株產(chǎn)生的胞外多糖對細(xì)菌的黏附以及在競爭環(huán)境中的存活和生長都具有重要的作用[3]。近年來，研究發(fā)現(xiàn)多種細(xì)菌的胞外多糖具有很強的生物學(xué)活性和醫(yī)學(xué)作用，然而淺白隱球菌一般是一種病原菌，有進一步分析多糖的潛在研究價值。

1 材料與方法

1.1 材料

菌株：實驗室保藏編號為J2002的菌株（由羅布泊地區(qū)分離得到）；酵母菌基因提取試劑盒：OMIGA公司產(chǎn)品；PCR引物：由金斯瑞公司合成；KOD-Plus DNA Polymerase，dNTPs：TOYOBO公司產(chǎn)品；HhaⅠ、HaeⅢ、Hinf Ⅰ3種酶：TOYOBO公司產(chǎn)品；PCR擴增儀：Applied Biosystems公司生產(chǎn)；GIS-2009 凝膠成像儀：伯樂公司生產(chǎn)；DYY-6B電泳儀：北京六一公司生產(chǎn)；Bioloy生物自動分析儀以及96微孔板（YT板）：華粵公司生產(chǎn)；其他培養(yǎng)基所用試劑均為市售分析純試劑。

1.2 方法

1.2.1 酵母菌的鑒定

1.2.1.1 酵母菌形態(tài)觀察 酵母菌在YPD斜面培養(yǎng)基（YPD培養(yǎng)基：葡萄糖2%，蛋白胨2%，酵母提取物1%，瓊脂粉2%）30 ℃條件下培養(yǎng)2 d，直接刮取制成玻片，在顯微鏡下觀察未染色以及染色后的酵母菌的形態(tài)，同時又將活化的酵母菌轉(zhuǎn)接到液體培養(yǎng)基上30 ℃過夜培養(yǎng)，稀釋涂布于平板上觀察酵母菌的外觀形態(tài)。

1.2.1.2 酵母菌生理生化試驗 酵母菌的生理生化試驗主要是利用Biolog自動分析儀來進行。將分離到的純種用棉簽挑到無菌水中，配成指定細(xì)胞濃度的（酵母菌為47%[4]，由比濁儀測量濁度）菌懸液。將菌懸液按每孔100 μL的量加到Y(jié)T板（即96微孔孵育板）后孵育（此孵育條件根據(jù)儀器掃描所要的培養(yǎng)條件來定，各種菌有不同的培養(yǎng)需要，酵母菌為 26 ℃ 孵育）。所有孔在剛開始時候都是無色的，當(dāng)孵育一段時間之后，那些能被細(xì)胞利用的碳源孔中的呼吸作用增強了。增強呼吸作用導(dǎo)致四唑氧化還原染料被還原，變成紫色。同時，能被利用的碳源孔中的微生物也開始生長，導(dǎo)致濁度變高。孵育24、48、72 h后，通過YT板上顯紫色及濁度變化所產(chǎn)生的指紋圖譜同Biolog數(shù)據(jù)庫中的數(shù)據(jù)進行比對。如果找到匹配的，所分離出來的微生物即可得到鑒定。

1.2.1.3 酵母菌的26S rDNA的D1/D2區(qū)域基因序列分析 以提取的酵母菌總DNA為模板，用真菌26S rDNA的 D1/D2 區(qū)通用引物NL1 和NL4[5]（NL1：5′-GCATATCAATAAGCGGAAAAG-3′；NL4：5′-GGTCCGTGTTTCAAGACG-3′）作為上下游引物，擴增菌株26S rDNA的D1/D2區(qū)域片段，PCR條件為：94 ℃預(yù)變性2 min，94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，68 ℃延伸45 s。PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳驗證，將純化后的PCR產(chǎn)物送至金斯瑞公司測序，拼接后的26S rDNA D1/D2區(qū)序列于NCBI-GenBank 數(shù)據(jù)庫中的進行搜索，應(yīng)用BLAST工具與已登陸的酵母菌26S rDNA 序列進行比對，并利用軟件MEGA制成系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.1.4 酵母菌的5.8S rDNA-RFLP酶切 以提取的酵母菌的總DNA為擴增模版，以ITS1/ITS4[6]（ITS1：5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGC-3′；ITS4 5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）為上下游引物擴增5.8S-ITS區(qū)域，PCR條件為：94 ℃預(yù)變性2 min，94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，68 ℃ 延伸45 s。將擴增的片段用3種限制酶，分別是HhaⅠ、HaeⅢ、 Hinf Ⅰ[7]進行單酶切，酶切的片段在TBE緩沖液中電泳。電泳結(jié)果與由 Esteve-Zarzoso等在1999年首次做的5.8S rDNA-RFLP的酶切圖譜大全[8]進行比對。

1.2.2 酵母菌生長條件的研究

1.2.2.1 溫度對酵母菌生長的影響 酵母菌于YPD斜面培養(yǎng)基上30 ℃活化2 d，繼而轉(zhuǎn)接于YPD液體培養(yǎng)基，液體培養(yǎng)基的裝液量為50 mL，接種量為2%。30 ℃過夜培養(yǎng)，調(diào)整到統(tǒng)一的D600 nm=1.0，進行2次擴大培養(yǎng)，培養(yǎng)條件相同，設(shè)計不同的溫度；溫度分別為27、30、33、36、39、41 ℃，不同溫度下通過D600 nm值檢測其細(xì)胞生長密度。

1.2.2.2 pH值對酵母菌生長的影響 酵母菌于YPD斜面培養(yǎng)基上活化2 d，培養(yǎng)條件同上，調(diào)整到統(tǒng)一的D600 nm=10，再次轉(zhuǎn)接到Y(jié)PD液體培養(yǎng)基中，設(shè)計不同的pH值：pH值分別為1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、110、12.0、13.0、14.0，在不同pH值下通過D600nm處的值簡單檢測其生長狀況。

1.2.2.3 酵母菌生長曲線的研究 在YPD斜面培養(yǎng)活化酵母菌，轉(zhuǎn)接到Y(jié)PD培養(yǎng)液中過夜培養(yǎng)，調(diào)整到統(tǒng)一的D600 nm為1.0，2次轉(zhuǎn)接于YPD培養(yǎng)液中，于30 ℃培養(yǎng)條件下，根據(jù)培養(yǎng)時間、生長密度，繪制出其培養(yǎng)周期內(nèi)的生長曲線。

1.2.3 淺白隱球酵母產(chǎn)物的發(fā)現(xiàn)及含量測定 淺白隱球酵母的產(chǎn)物方面已報道過的一般為油脂[9-10]，但是這株經(jīng)過強輻射后的淺白隱球酵母的產(chǎn)物中有多糖。菌體以YPD培養(yǎng)基按上述培養(yǎng)條件培養(yǎng)6～8 h，控制菌數(shù)大約在1×107個/mL，按上述接種量轉(zhuǎn)接至發(fā)酵培養(yǎng)基。發(fā)酵培養(yǎng)基含葡萄糖3%、硫酸銨0.3%、酵母提取物0.2%、水硫酸鎂0.05%。培養(yǎng)基也以上述培養(yǎng)基條件培養(yǎng)，多糖含量以改進的苯酚-硫酸法跟蹤測定[11]。10 mg葡萄糖定容至100 mL，根據(jù)表1內(nèi)容繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2 結(jié)果與分析

2.1 酵母菌碳氮源的利用分析及其檢測

利用Biolog自動掃描儀進行的分析，對碳/氮檢測結(jié)果見表2。

由表2可以初步得出，該酵母菌是淺白隱球酵母。根據(jù)源數(shù)據(jù)進行分析，該酵母菌能利用多種碳氮源，具體利用情況見表3，并且經(jīng)過驗證試驗發(fā)現(xiàn)，對于葡萄糖跟蔗糖的利用程度差不多，可利用碳源有：糊精、菊糖、纖維二糖、龍膽二糖、麥芽糖、麥芽三糖、松三糖、棉籽糖、海藻糖。處于臨界值：乙酸、琥珀酸、異麥芽酮糖、山梨糖、水楊苷、山梨醇、阿拉伯糖醇。與《酵母菌的特征與鑒定手冊》中淺白隱球酵母的同化試驗數(shù)據(jù)相比大多碳氮源利用相同。

2.2 酵母菌的26S rDNA的D1/D2區(qū)域基因序列以及樹狀圖分析

以NL1 和NL4 作為上下游引物，擴增菌株26S rDNA的D1/D2區(qū)域片段，片段長度在700 bp左右，電泳結(jié)果見圖1。

該電泳結(jié)果條帶單一，將此產(chǎn)物純化后送至金斯瑞公司測序，反饋的序列經(jīng)過比對的系統(tǒng)發(fā)育樹見圖2。

系統(tǒng)發(fā)育樹的分支表示是親緣關(guān)系，離得越遠(yuǎn)親緣關(guān)系越低，彼此靠近的二者基本可以認(rèn)定為同種（如果blast出來后發(fā)現(xiàn)二者同源性非常高的話），而它們之間那個數(shù)值表示這個同源性的可靠程度多高。數(shù)值越高表示二者的親緣關(guān)系（也就是同種）越可信。一般要>95才能表示是同種，66以上可以表示是亞種或者變種之類。構(gòu)建此酵母系統(tǒng)發(fā)育樹時，選擇了相似性高達95%以上的序列作為比對對象，分析出該酵母菌與模式菌株10666等構(gòu)成1個大分支，與淺白隱球酵母為同1個種，與羅倫隱球酵母為亞種關(guān)系或者變種（圖2）。

2.3 酵母菌5.8S rDNA-RFLP單酶切結(jié)果

以引物擴增5.8S-ITS區(qū)域PCR產(chǎn)物電泳見圖3，片段長度大概在600bp左右，酶切片段見圖4。圖中目的條帶清〗

晰而明亮，長度約為600 bp，但是有雜帶和引物二聚體條帶，本試驗將目的條帶切膠回收后進行單酶切反應(yīng)。

從圖3、圖4看出，第一泳道為HaeⅢ酶切片段，片段長度為500+70+60 bp；第二泳道為HhaⅠ酶切片段，片段長度為330+330 bp；HinfⅠ酶切片段，片段長度為350+160+120 bp。參照 Esteve-Zarzoso等在1999年首次做的5.8S rDNA-RFLP的酶切圖譜大全的結(jié)果可以判定此酵母菌為淺白隱球酵母。

2.4 溫度、pH值對淺白隱球酵母生長的影響

將淺白隱球酵母培養(yǎng)于YPD培養(yǎng)基上，進行2次轉(zhuǎn)接后以D600nm為指標(biāo)檢測其生長狀態(tài)，結(jié)果見圖5、圖6。

由于該淺白隱球酵母取自新疆羅布泊強輻射地區(qū)，生長特性比一般酵母菌頑強，能在比較高的溫度（39 ℃）下生長，除此之外強酸強堿（pH值3～13）下也能較好地生長。相關(guān)特性還需進一步研究。

2.5 淺白隱球酵母在最適溫度以及pH值下的各生長時期

淺白隱球酵母于最適培養(yǎng)條件下探究其各個時期的具體生長時間。

這株淺白隱球酵母的各生長時期與典型的酵母菌的生長有很大的相似之處，在生長4～5 h后進入對數(shù)生長期，在 22～24 h 后進入延緩期，27 h后進入衰退期（圖7）。

2.6 淺白隱球酵母形態(tài)特征

此株淺白隱球酵母呈現(xiàn)圓形或者卵圓形，以出芽生殖為主，菌落為乳白色，圓形，凸起，邊緣光滑（圖8、圖9）。

2.7 淺白隱球酵母多糖的含量

樣品處理為1 mL樣品液加1 mL蒸餾水，加1 mL 6%的苯酚，加5 mL的濃硫酸，沸水浴10 min加熱后以流水徹底冷卻，在490 nm處測吸光度。葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖10。將測得的多糖D值換算成稀釋后的值代入葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到多糖含量見圖11，多糖含量及活菌率見表4。

由圖10得到葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合方程為y=0.047 5x+0.014 8，r=0.999 7。該曲線方程的趨勢線擬合度很高，相關(guān)系數(shù)高達0.999 7。

根據(jù)以上結(jié)果可以得出，淺白隱球酵母產(chǎn)物中的多糖含量最高可達0.9 mg/mL，在搖瓶發(fā)酵至18 h后，產(chǎn)量達到最高后隨著菌體死亡速度的加快而下降。

3 結(jié)論與討論

經(jīng)多種方法鑒定得知，該酵母菌為淺白隱球酵母。該菌株生長能夠耐受較高溫度，最高溫度能達到39 ℃， 該菌株能在強酸強堿中生存，最酸壞境pH值僅為3.0，最高堿度pH值可達13。經(jīng)試驗驗證發(fā)現(xiàn)，自新疆羅布泊地區(qū)分離所得的該淺白隱球酵母菌具有一定的抗輻射性能。酵母菌耐輻射性質(zhì)揭示，可能該酵母菌自身所產(chǎn)生的物質(zhì)如多糖、蛋白質(zhì)或者多糖與蛋白的復(fù)合物，本菌株的產(chǎn)物可能是多糖具有抗輻射性能，相關(guān)報道認(rèn)為，多糖等物質(zhì)能耐受輻射，王璐璐研究發(fā)現(xiàn)，多糖AEPS具有清除自由基的能力，尤其是對羥基自由基和超氧陰離子的清除能力非常顯著[12]；也有可能是酵母菌本身的生長、代謝機制在外界條件下發(fā)生了變化，進一步研究，有可能找到一種微生物耐輻射的新機制，有望將這類酵母菌選作其他有利于微生物生長的候選產(chǎn)物的宿主細(xì)胞；也有可能就是此酵母菌自身的某些特定基因的表達能耐受強輻射，張永芹等利用pprI 基因轉(zhuǎn)染救治小鼠致死性輻射損傷的研究表明，PprI 蛋白質(zhì)有可能成為一種新的來自原核生物的輻射防護劑[13]。他們研究發(fā)現(xiàn)，pprI 基因是一個對電離輻射抗性起關(guān)鍵作用的DNA 修復(fù)開關(guān)基因。

無論是尋找到抗輻射產(chǎn)物，還是尋找耐輻射相關(guān)基因，對這1株特殊條件地域獲得的淺白隱球酵母的進一步研究都有可能發(fā)現(xiàn)宿主細(xì)胞或者表達產(chǎn)物的新視野。

參考文獻：

[1]李金霞，程 池，姚 粟，等. Biolog微生物自動分析系統(tǒng)——酵母菌鑒定操作規(guī)程的研究[J]. 食品與發(fā)酵工業(yè)，2006，32（7）：50-53.

[2]程 池，楊 梅，李金霞，等. 微生物自動分析系統(tǒng)——細(xì)菌鑒定操作規(guī)程的研究[J]. 食品與發(fā)酵工業(yè)，2006，32（5）：50-54.

[3]Costerton J W，Irvin R T，Cheng K J. The bacterial glycocalyx in nature and disease[J]. Annual Review of Microbiology，1981，35：299-305.

[4]Praphailong W，van Gestel M，F(xiàn)leet G H，et al. Evaluation of the biolog system for the identification of food and beverags yeasts[J]. Letters in Applied Microbiology，1997，24：455-459.

[5]Kurtzman C P，Christie J R. Identification and phylogeny of ascomycetous yeasts from analysis of nuclear large subunit（26S） ribosomal DNA partial sequences[J]. Antonie van Leeuwenhoek，1998，73（4）：331-371.

[6]Tay S T，Na S L，Tajuddin T H. Natural occurrence and growth reaction on canavanine-glycine-bromothymol blue agar of non-neoformans Cryptococcus spp.in Malaysia[J]. Original Article，2008，52：515-519.

[7]N′ Guessan K F ， Brou K，Jacques N ，et al.Identification of yeasts during alcoholic fermentation of tchapalo，a traditional sorghum beer from Cted，Ivoire[J]. Antonie van Leeuwenhoek，2011，99：855-864.

[8]Esteve-Zarzoso B，Belloch C，Uruburu F，et al. Identification of yeasts by RFLP analysis of the 5.8S rRNA gene and the two ribosomal internal transcribed spacers[J]. International Journal of Systematic Bacteriology，1999，49：329-337.

[9]吳開云，程俊文，李紀(jì)元，等. 淺白隱球酵母產(chǎn)油工程菌液體深層發(fā)酵技術(shù)研究[J]. 湖南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012（21）：12-15.

[10]中國林業(yè)科學(xué)研究院亞熱帶林業(yè)研究所. 一種高產(chǎn)油酸的淺白隱球酵母工程菌株的構(gòu)建方法：中國，CN 101892250 A[P]. 2010-11-04.

[11]Dubois M，Gilles K A，Hamilton J K，et al. A colorimetric method for the determination of sugars[J]. Nature，1951，28（7）：167-168.

[12]王璐璐. 土芽孢桿菌TS3-9胞外多糖的初步研究[D]. 杭州：浙江工商大學(xué)，2013：1-82.

[13]張永芹，周 輝，陳 潔，等. 耐輻射球菌PprI蛋白質(zhì)表達及其純化的實驗研究[J]. 輻射研究與輻射工藝學(xué)報，2011，29（2）：117-122.