畢海丹 萬照東 崔旭海 李雙雙

摘要：采用醇提法探索花生殼中總黃酮的最佳提取工藝，并研究其抑菌活性。結(jié)果表明：花生殼總黃酮的最佳提取工藝為乙醇溶液濃度80%、提取溫度80 ℃、提取時(shí)間3.0 h、料液比1 g ∶20 mL，各因素對(duì)總黃酮得率的影響由大到小依次為提取溫度、乙醇溶液濃度、料液比、提取時(shí)間；驗(yàn)證試驗(yàn)表明，最佳提取工藝下花生殼總黃酮得率為0618%；抑菌試驗(yàn)表明，花生殼總黃酮對(duì)大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌具有一定抑菌作用，且其抑菌效果遠(yuǎn)優(yōu)于山梨酸鉀。

關(guān)鍵詞：花生殼；總黃酮；提取；抑菌活性；正交試驗(yàn)

中圖分類號(hào)： TS201.2 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：1002-1302（2015）07-0297-03

中國(guó)是花生生產(chǎn)大國(guó)，花生種植廣泛分布于全國(guó)各地，花生產(chǎn)量居世界第1位?；ㄉ鷼な腔ㄉ摎ぜ庸ざa(chǎn)生的農(nóng)副產(chǎn)品，其質(zhì)量約占花生莢果總質(zhì)量的30%左右。我國(guó)花生年產(chǎn)量約1 460萬t，其中花生殼質(zhì)量就高達(dá)450萬t[1]。有研究將花生殼熱壓成型制作塑木板，或加工成飼料、燃料等，但大部分花生殼被作為廢棄物扔掉，不但會(huì)破壞環(huán)境，而且造成了極大的資源浪費(fèi)。黃酮類化合物具有清除體內(nèi)自由基及毒素、預(yù)防心血管疾病以及抗過敏、抗腫瘤、廣譜抗菌、抗病毒等作用[2-7]。本研究選用花生殼作為原料優(yōu)化黃酮類化合物的提取工藝，并進(jìn)行了抑菌試驗(yàn)，以期為降低黃酮類產(chǎn)品生產(chǎn)成本、拓展花生綜合利用領(lǐng)域奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料

將花生殼清洗烘干，冷卻至室溫，粉碎至通過孔徑0.3 mm的網(wǎng)篩后，脫脂，備用。蕓香苷標(biāo)準(zhǔn)品（純度99%）購(gòu)于成都生物科技有限公司；大腸桿菌（Escherichia coli）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）由棗莊學(xué)院生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心微生物實(shí)驗(yàn)室提供；培養(yǎng)基為瓊脂營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基。

1.1.2 儀器

AL104型電子天平（瑞士梅特勒-托利多有限公司）；FW100型高速萬能粉碎機(jī)（天津市泰斯特儀器有限公司）；JJ-1型精密增力電動(dòng)攪拌器（江蘇省金壇市金城國(guó)勝實(shí)驗(yàn)儀器廠）；R2018-Ⅱ型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司）；DK-S26型數(shù)顯恒溫水浴鍋（上海三發(fā)科學(xué)儀器有限公司）；SHB-ⅢA型循環(huán)水式多用真空泵（鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司）；BM2000型生物顯微鏡（南京江南永新光學(xué)有限公司）；PLY-45型恒溫培養(yǎng)箱（天津市萊玻特瑞儀器設(shè)備有限公司）；SW-CJ-2FD型超凈工作臺(tái)（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）；BXM-30R型高壓蒸汽滅菌鍋（上海博訊實(shí)業(yè)有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 蕓香苷標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

稱取蕓香苷標(biāo)準(zhǔn)品0.01 g，用70%乙醇溶液溶解，定容至50 mL容量瓶中，得到0.2 g/L蕓香苷標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別吸取蕓香苷標(biāo)準(zhǔn)溶液0、1、2、3、4、5 mL于 10 mL 容量瓶中，先加70%乙醇溶液至5 mL左右，然后加入5%NaNO2 溶液0.3 mL，搖勻放置6 min后加入10% Al（NO3）3溶液0.3 mL，搖勻放置6 min后加入1 mol/L NaOH溶液2 mL，混勻；用70%乙醇溶液定容至刻度線，搖勻，放置20 min。用1 cm比色皿于510 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為y=15.343x-0.020 5（r2=0.998 7）。

1.2.2 花生殼總黃酮的提取

稱取花生殼粉5 g，提取溫度分別設(shè)置為50、60、70、80、90 ℃，回流提取時(shí)間分別為1、2、3、4、5 h，料液比分別為1 g ∶10 mL、1 g ∶15 mL、1 g ∶20 mL、1 g ∶25 mL、1 g ∶30 mL，分別以梯度濃度50%、60%、70%、80%、90%的乙醇溶液作為提取溶劑提取總黃酮，采用硝酸鋁比色法測(cè)定總黃酮吸光度。

1.2.3 總黃酮得率的計(jì)算 花生殼黃酮得率=花生殼黃酮含量/花生殼粉質(zhì)量×100%。

1.2.4 花生殼總黃酮的抑菌試驗(yàn)

用紙片擴(kuò)散法測(cè)定花生殼總黃酮的抑菌作用[8-9]。將滅過菌的直徑5 mm的濾紙片放入不同濃度花生殼總黃酮溶液中浸泡1 h，備用。吸取濃度為5×107個(gè)/mL的菌懸液0.2 mL，用涂布法接種在培養(yǎng)基上，將濾紙片放入該含菌培養(yǎng)皿中，置于恒溫生化培養(yǎng)箱中，于 37 ℃ 恒溫培養(yǎng)1 d，測(cè)量抑菌圈直徑。每個(gè)樣品3次重復(fù)，空白對(duì)照為無菌蒸餾水。

1.2.5 花生殼總黃酮和山梨酸鉀的抑菌活性比較

采用固體平板培養(yǎng)基稀釋法測(cè)定抑菌活性[10]。取無菌試管10支，向后9支試管分別加入1mL無菌蒸餾水，取花生殼總黃酮提取液1 mL 移入1號(hào)試管，混勻后取出1 mL混合液轉(zhuǎn)入2號(hào)試管，依次操作，至9號(hào)試管取出1 mL混合液棄去，將黃酮提取液分別稀釋1、2、4、8、16、32、64、128、256倍。1～9號(hào)試管中均含有1 mL不同稀釋度的提取液，10號(hào)試管為空白對(duì)照。在每支試管中加入9 mL熔化至55 ℃的固體瓊脂培養(yǎng)基，充分混勻，傾注入平板，平板凝固后，接0.1 mL的菌液于37 ℃培養(yǎng)1 d。以培養(yǎng)基中完全沒有菌生長(zhǎng)時(shí)的最低濃度為最低抑菌濃度（MIC），根據(jù)MIC 初步確定抑菌濃度范圍。山梨酸鉀對(duì)供試菌的MIC測(cè)定方法同上。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1.1 乙醇溶液濃度對(duì)總黃酮得率的影響

由圖1可知，當(dāng)乙醇溶液濃度為50%～70%時(shí)，總黃酮得率隨著乙醇溶液濃度增大而提高；當(dāng)乙醇溶液濃度為70%～90%時(shí)，總黃酮得率隨著乙醇溶液濃度增大而逐漸降低。由此可見，提取花生殼總黃酮的最優(yōu)乙醇溶液濃度為70%。

2.1.2 提取時(shí)間對(duì)總黃酮得率的影響

由圖2可知，總體上看，隨著提取時(shí)間延長(zhǎng)，花生殼總黃酮得率不斷提高。提取時(shí)間2.0 h下的總黃酮得率明顯比提取時(shí)間1 h下的總黃酮得率高；提取時(shí)間從2.0 h延長(zhǎng)到3.0 h時(shí)，總黃酮得率提高相對(duì)緩慢；提取時(shí)間為3.0～5.0 h時(shí)，隨著提取時(shí)間延長(zhǎng)，總黃

酮得率提高不明顯?？紤]到工業(yè)化生產(chǎn)時(shí)應(yīng)節(jié)約時(shí)間、能源等問題，提取花生殼總黃酮的適合時(shí)間為3.0 h。

2.1.3 提取溫度對(duì)總黃酮得率的影響

圖3表明，提取溫度為50～60 ℃時(shí)，隨著提取溫度升高，總黃酮得率明顯提高；提取溫度為60～80 ℃時(shí)，隨著提取溫度升高，總黃酮得率提高相對(duì)緩慢；提取溫度為80～90 ℃時(shí)，隨著提取溫度升高，總黃酮得率卻呈下降趨勢(shì)。說明提取花生殼總黃酮的最優(yōu)溫度為70 ℃。

2.1.4 料液比對(duì)總黃酮得率的影響

圖4表明，當(dāng)料液比由1 g ∶10 mL變化至1 g ∶20 mL時(shí)，總黃酮得率也隨之不斷增大；當(dāng)料液比由1 g ∶20 mL變化至1 g ∶30 mL時(shí)，總黃酮得率反而下降。說明提取花生殼總黃酮的最佳料液比為 1 g ∶20 mL。

2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果與分析

花生殼總黃酮提取工藝正交試驗(yàn)方案與結(jié)果分別見表1、表2。由表2可見，RA>RB>RD>RC，因此在一定范圍內(nèi)，4個(gè)因素對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響是不同的，提取溫度對(duì)試驗(yàn)結(jié)果影響最大，其次是乙醇溶液濃度、料液比，最后是提取時(shí)間?；ㄉ鷼ぬ崛】傸S酮的最優(yōu)工藝條件為A3B3C2D2，即提取溫度80 ℃、乙醇溶液濃度80%、提取時(shí)間 3.0 h、料液比1 g ∶20 mL。在該條件下做驗(yàn)證試驗(yàn)，測(cè)得花生殼中總黃酮得率為0.618%。

2.3 抑菌試驗(yàn)結(jié)果與分析

由表3可知，花生殼總黃酮濃度與其抑菌效果呈正相關(guān)，表明花生殼總黃酮對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌均有明顯的抑制作用。當(dāng)花生殼總黃酮濃度為2.0 g/L時(shí)，上述3種菌的抑菌圈直徑均大于7.0 mm，花生殼總黃酮尤其對(duì)金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的抑制效果明顯，其抑菌圈直徑分別為7.6、8.2 mm。當(dāng)花生殼總黃酮濃度為 0.5 g/L 時(shí)，金黃色葡萄球菌、大腸桿菌的抑菌圈直徑差異不明顯，這可能與花生殼總黃酮濃度過低，對(duì)這2種菌的破壞能力差異不明顯有關(guān)。

2.4 花生殼總黃酮和山梨酸鉀的抑菌活性比較

花生殼總黃酮濃縮原液中黃酮含量為15.45 g/L，山梨酸

3 結(jié)論

本研究表明，提取花生殼總黃酮的最佳工藝條件為提取溫度80 ℃、乙醇溶液濃度80%、提取時(shí)間3.0 h、料液比 1 g ∶20 mL。各因素對(duì)總黃酮得率的影響由大到小依次為提取溫度、乙醇溶液濃度、料液比、提取時(shí)間。驗(yàn)證試驗(yàn)表明，最佳工藝條件下花生殼總黃酮得率為0.618%。抑菌試驗(yàn)表明，花生殼總黃酮對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌均有抑菌作用，且其抑菌效果遠(yuǎn)高于山梨酸鉀，具有作為食品抑菌劑的良好開發(fā)前景。

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