張欣倪　王鴻磊　丁強(qiáng)　呂蔚　鄒積華　崔從光　俞守能

摘要：利用RAPD和酯酶同工酶指紋圖譜對(duì)國(guó)內(nèi)主栽的2個(gè)雙孢菇菌株及從荷蘭、美國(guó)引進(jìn)的8個(gè)雙孢菇菌株進(jìn)行親緣關(guān)系分析。結(jié)果表明，從47個(gè)RAPD引物中篩選了14個(gè)條帶清晰重復(fù)性好的引物，共產(chǎn)生了88條清晰的擴(kuò)增條帶，其中多態(tài)性條帶64條，多態(tài)性位點(diǎn)百分率為72.73%，10個(gè)菌株可分為4個(gè)類群；酯酶同工酶電泳共擴(kuò)增出了清晰條帶7條，其中多態(tài)性條帶6條，多態(tài)性位點(diǎn)百分率為85.8%，10個(gè)菌株可分為3個(gè)類群。2種技術(shù)均顯示，國(guó)內(nèi)菌株與國(guó)外引進(jìn)菌株之間親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。因此，引進(jìn)國(guó)外優(yōu)質(zhì)雙孢菇菌株對(duì)增加中國(guó)雙孢菇遺傳多樣性具有重要作用。

關(guān)鍵詞：雙孢菇；酯酶同工酶；RAPD；親緣關(guān)系

中圖分類號(hào)： S646.032 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：1002-1302（2015）07-0254-03

雙孢菇（Agaricus bisporus）是中國(guó)廣泛栽培的一種中低溫性食用菌，近年來產(chǎn)量不斷增加。但是，中國(guó)的雙孢蘑菇品種之間遺傳關(guān)系較近[1]，且缺乏系統(tǒng)的歸類整理，導(dǎo)致中國(guó)目前市場(chǎng)上菌種的同種品種不同名稱，或者是不同品種同一名稱的混雜現(xiàn)狀，直接影響了中國(guó)雙孢菇菌種的生產(chǎn)、種質(zhì)資源的保護(hù)和優(yōu)良菌種選育。采用合理有效技術(shù)對(duì)雙孢蘑菇進(jìn)行品種劃分，區(qū)分其品種親緣關(guān)系，鑒定雙孢蘑菇的品系顯得尤為重要。

RAPD技術(shù)是Williams研究小組提出的一種分子標(biāo)記技術(shù)[2-3]。該技術(shù)通過人工合成的核酸單鏈（常為10個(gè)堿基）為引物，以試驗(yàn)對(duì)象的DNA為模版，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)生一系列不同分子量的基因片段，不同引物的凝膠電泳結(jié)果，可以作為品系的遺傳特征進(jìn)行記錄，用于品種鑒定。RAPD技術(shù)設(shè)備簡(jiǎn)單，技術(shù)簡(jiǎn)便易行，目前，已廣泛應(yīng)用于不同物種的遺傳多樣性研究[4-9]。同工酶分子標(biāo)記是從基因產(chǎn)物水平來研究生物的遺傳變異，是一種重要的分子遺傳標(biāo)記技術(shù)[10]，酶帶的變化可作為鑒定物種，研究分類、進(jìn)化、遺傳與變異的重要指標(biāo)。自1959年Markert等提出酯酶同工酶概念后，酯酶同工酶標(biāo)記技術(shù)在許多食用菌研究中得到了廣泛的重視和應(yīng)用[11-14]。高分辨率的同工酶技術(shù)成為生化分類的主要方法之一[15]。

本研究利用RAPD和酯酶同工酶技術(shù)對(duì)中國(guó)的2個(gè)主栽雙孢菇菌株及從荷蘭、美國(guó)引進(jìn)的8個(gè)優(yōu)質(zhì)雙孢菇菌株進(jìn)行遺傳相似性分析，從分子水平上研究雙孢菇菌株之間的親緣關(guān)系和遺傳差異，為雙孢菇菌株的鑒定提供技術(shù)支持，同時(shí)為雙孢菇種質(zhì)資源的引進(jìn)及引進(jìn)菌株在雙孢菇遺傳育種方面的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種 （1）258、2796本實(shí)驗(yàn)室保藏；（2）H901、HRLM、F3F、HA15引自荷蘭；（3）L901、5113、XXX、2200引自美國(guó)。

1.1.2 PCR試劑 RAPD引物由英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司合成，Taq DNA 聚合酶、dNTP、DNA marker、Gelstain等購自北京全式金生物技術(shù)有限公司。

1.1.3 儀器設(shè)備 JY300C電泳儀：北京君意東方電泳設(shè)備有限公司生產(chǎn)；藍(lán)盾580可見光凝膠電泳透射儀：廈門致善生物科技有限公司生產(chǎn)；A200PCR儀：杭州朗基科學(xué)儀器有限公司生產(chǎn)；04S-3C全自動(dòng)數(shù)碼凝膠圖像分析系統(tǒng)：北京君意東方電泳設(shè)備有限公司生產(chǎn)；3K30冷凍高速離心機(jī)：德國(guó)Sigma公司生產(chǎn)。

1.2 方法

1.2.1 RAPD分析 雙孢菇菌株利用PDA液體培養(yǎng)基[16]，24 ℃ 150 r/min 培養(yǎng)14 d，過濾收集菌絲體。菌絲體DNA提取采用CTAB法[17]。0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA質(zhì)量，紫外分光光度計(jì)檢測(cè) DNA濃度，稀釋至10 ng/μL，于-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?。PCR反應(yīng)體系為15 μL，含1×PCR緩沖液、DNA模板 20 ng，dNTPs 200 mmol/L，引物0.3 μmol/L，TaqDNA聚合酶 1 U。PCR反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性7 min；94 ℃變性1 min，退火1 min（退火溫度視引物而定），72 ℃延伸2 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸7 min，4 ℃終止反應(yīng)。PCR產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，電壓4 V/cm，Gelstain染色，凝膠成像系統(tǒng)觀察并照相。

1.2.2 酯酶同工酶分析 稱取0.5 g菌絲體，置于預(yù)冷的滅菌研缽中，加1 mL 樣品提取液，加少量滅菌石英砂，冰浴研磨，收集于1.5 mL離心管中。4 ℃ 10 000 r/min 離心5 min，將上清液、蔗糖溶液、溴酚藍(lán)溶液按5 ∶1 ∶1的比例混合，即為電泳樣品[18]。電泳分離膠濃度為7.5%，濃縮膠濃度為48%，電極緩沖液采用Tris-Gly系統(tǒng)，以1%溴酚藍(lán)作指示劑。電泳初始電流10 mA，待樣品進(jìn)入分離膠后電流升至 20 mA，在0～4 ℃下電泳至溴酚藍(lán)指示劑距膠底1 cm停止電泳。用1%醋酸-1-萘酯、2%醋酸-2-萘酯和固藍(lán)RR鹽4 ℃染色15～30 min，用蒸餾水沖洗數(shù)次后置于乙酸溶液中固定，凝膠成像系統(tǒng)拍照[19]。

1.2.3 數(shù)據(jù)處理 利用NTSYSpc 2.10對(duì)電泳條帶進(jìn)行分析，計(jì)算各雙孢菇菌株間的Nei氏遺傳相似性及遺傳距離，以平均連鎖法（UPGMA）進(jìn)行聚類分析，得出聚類圖譜[20]。

2 結(jié)果與分析

2.1 雙孢菇菌株RAPD分析

利用47條引物對(duì)10個(gè)雙孢菇菌株進(jìn)行了RAPD擴(kuò)增，其中14條引物擴(kuò)增出了清晰且具有多態(tài)性的條帶，共產(chǎn)生了清晰的擴(kuò)增條帶88條，其中多態(tài)性條帶64條，多態(tài)性位點(diǎn)百分率為72.73%，結(jié)果見表1。

利用NTSYSpc 2.10計(jì)算菌株間遺傳距離，以平均連鎖法（UPGMA）對(duì)10個(gè)雙孢菇菌株進(jìn)行聚類分析，構(gòu)建10個(gè)雙孢菇菌株的親緣關(guān)系圖譜（圖1）。

從RAPD聚類圖（圖1）可見，8個(gè)引進(jìn)菌株與2個(gè)國(guó)內(nèi)主栽菌株的差異明顯，遺傳相似性只有0.53，在聚類圖上明顯分為2個(gè)分支。國(guó)內(nèi)主栽的2個(gè)品種遺傳差異較小，相似性達(dá)到0933，可歸為1個(gè)類群。國(guó)外引進(jìn)的8個(gè)菌株可分為3個(gè)類群，其中HRLM菌株與其他7個(gè)菌株差異較大，單獨(dú)歸為1個(gè)類群。引自美國(guó)的L901和引自荷蘭的F3F、HA15親緣關(guān)系較近，歸為1個(gè)類群，荷蘭菌株H901與美國(guó)菌株5113、2200、XXX歸為1個(gè)類群，這2個(gè)類群親緣關(guān)系較近，遺傳相似性接近0.88。

2.2 酯酶同工酶聚類分析

10個(gè)雙孢菇菌株酯酶同工酶圖譜見圖2，共擴(kuò)增出了清晰條帶7條，其中多態(tài)性條帶6條，多態(tài)性位點(diǎn)百分率為85.8%。

利用NTSYSpc 2.10計(jì)算菌株間遺傳距離，以平均連鎖法

（UPGMA）對(duì)10個(gè)雙孢菇菌株進(jìn)行聚類分析，構(gòu)建10個(gè)雙孢菇菌株的親緣關(guān)系圖譜（圖3）。

10個(gè)不同品種雙孢蘑菇的酯酶同工酶電泳圖譜帶在位置、寬窄、濃淡以及數(shù)量等方面都體現(xiàn)出了一定的差異性。從圖譜上看，10個(gè)雙孢菇菌種分為3群，中國(guó)品種2796、258、荷蘭品種HRLM譜帶相同，荷蘭菌種H901、HA15、美國(guó)菌種L901譜帶相同，美國(guó)菌種5113、XXX、2200和荷蘭菌種F3F譜帶相同。中國(guó)品種與HRLM親緣關(guān)系較近，而其他引進(jìn)品種間親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

3 討論

中國(guó)是雙孢菇生產(chǎn)大國(guó)，但不是雙孢菇生產(chǎn)強(qiáng)國(guó)，菌種是制約中國(guó)雙孢菇產(chǎn)業(yè)發(fā)展最重要的因素之一。我國(guó)雙孢菇菌株親緣關(guān)系過于接近，影響我國(guó)雙孢菇育種等工作的順利開展。本研究結(jié)果表明，國(guó)外優(yōu)質(zhì)雙孢菇菌株與中國(guó)主栽菌株之間親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，為我國(guó)雙孢菇產(chǎn)業(yè)發(fā)展提供了一條新的思路。通過引進(jìn)國(guó)外優(yōu)質(zhì)菌株，與國(guó)內(nèi)菌株進(jìn)行雜交育種，對(duì)提高中國(guó)雙孢菇遺傳多樣性、雙孢菇產(chǎn)量和抗病性等方面具有重要的作用。

同時(shí)，國(guó)外菌株在遺傳相似性方面也相對(duì)比較接近，在引種時(shí)要對(duì)引進(jìn)菌株進(jìn)行親緣關(guān)系檢測(cè)，避免菌株的重復(fù)引進(jìn)。RAPD和酯酶同工酶電泳均可以反映菌株間的親緣關(guān)系[21]，而RAPD標(biāo)記檢測(cè)的多態(tài)性要遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于酯酶同工酶標(biāo)記[22]，同時(shí)，當(dāng)菌株親緣關(guān)系接近時(shí)酯酶同工酶酶譜與RAPD譜帶存在差異性。在實(shí)際應(yīng)用過程中，應(yīng)將二者有機(jī)結(jié)合起來，以獲得更加可靠的試驗(yàn)結(jié)果。

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