郭全海　趙耀光

摘要：通過研究慢性氟中毒對(duì)公雞生精細(xì)胞細(xì)胞周期的影響，探討慢性氟中毒對(duì)公雞睪丸組織造成損害的機(jī)制。試驗(yàn)將36羽160日齡的三黃公雞隨機(jī)均分為染氟組、對(duì)照組，并進(jìn)行常規(guī)飼養(yǎng)，對(duì)照組飲用自來水，染氟組飲用含量為3.25 g/L的NaF水。飼喂80 d后，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組公雞睪丸生精細(xì)胞的細(xì)胞周期變化。與對(duì)照組相比，染氟組公雞睪丸生精細(xì)胞于S期數(shù)量減少，并于G0/G1期數(shù)量增多，且G1期與S期的細(xì)胞數(shù)量呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系。試驗(yàn)結(jié)果表明，染氟組公雞睪丸生精細(xì)胞的細(xì)胞周期發(fā)生了顯著改變。

關(guān)鍵詞：氟中毒；公雞；睪丸組織；細(xì)胞周期

中圖分類號(hào)： S858.317.29 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：1002-1302（2015）07-0234-02

收稿日期：2014-10-29

基金項(xiàng)目：河南省商丘市科技計(jì)劃（編號(hào)：20122023）。

作者簡(jiǎn)介：郭全海（1980—），男，河南淮陽人，碩士，講師，主要從事分子生物學(xué)、免疫學(xué)、動(dòng)物疫病防治等方面的研究。E-mail：guohan611@163.com。

氟是動(dòng)物機(jī)體必需的微量元素，但其化學(xué)性質(zhì)活潑，安全范圍窄，過量攝入可引起氟中毒[1]。長期以來，人們對(duì)氟的研究主要集中于其對(duì)骨骼、牙齒等骨相組織的損害，而非骨相方面的研究卻很少。近年來有學(xué)者指出，慢性氟中毒可對(duì)機(jī)體非骨相組織造成很大損傷，已引起人們重視[2]。細(xì)胞從一次分裂結(jié)束到下一次分裂結(jié)束的時(shí)間稱為細(xì)胞周期，大量研究表明，氟化物可引起細(xì)胞周期的改變。采用細(xì)胞培養(yǎng)的方法觀察氟對(duì)二倍體成纖維細(xì)胞周期的影響，發(fā)現(xiàn)氟對(duì)不同細(xì)胞非同步化培養(yǎng)的敏感性不同[3]。Hayashi等研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞對(duì)氟的敏感性與細(xì)胞所處周期的不同時(shí)期有關(guān)[4]。氟可誘導(dǎo)嚙齒類動(dòng)物細(xì)胞染色體絲裂和斷裂，表明氟對(duì)嚙齒類動(dòng)物細(xì)胞周期中的G2期敏感。氟可使大鼠卵巢、小鼠卵巢及子宮的DNA、RNA含量減少。體外細(xì)胞培養(yǎng)氟可抑制DNA的合成，表明氟可影響核酸、蛋白質(zhì)的代謝[5]。國內(nèi)外關(guān)于氟對(duì)機(jī)體影響的研究多集中于體外培養(yǎng)細(xì)胞、小鼠、大鼠等，而氟對(duì)公雞睪丸組織細(xì)胞周期的影響尚未見報(bào)道。本研究在細(xì)胞生物學(xué)水平上探討氟對(duì)睪丸組織細(xì)胞周期的影響，為相關(guān)疾病的治療及研究提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

36羽160日齡雄性三黃雞購于商丘市梁園區(qū)某養(yǎng)雞場(chǎng)，該雞群曾對(duì)新城疫、傳染性法氏囊炎、傳染性支氣管炎進(jìn)行防疫，并對(duì)雞球蟲進(jìn)行過防治。

1.2 主要試劑及儀器

氟化鈉、75%乙醇、PI染液等購于南京凱基生物科技發(fā)展有限公司，自配PBS溶液。電子天平（上海天普分析儀器有限公司）、（江蘇國勝實(shí)驗(yàn)儀器廠）、Epics-prolie型流式細(xì)胞儀（Coulter公司）、恒溫水浴箱、低速離心機(jī)、渦旋振蕩混合器、200目尼龍濾網(wǎng)、手術(shù)剪刀、鑷子等。

1.3 試驗(yàn)動(dòng)物模型建立

試驗(yàn)用公雞經(jīng)飼養(yǎng)觀察無病后，隨機(jī)分為試驗(yàn)組、對(duì)照組，每組18羽。2組均自由采食全價(jià)飼料（購于正大集團(tuán)公司，含氟量符合國家標(biāo)準(zhǔn)）飼養(yǎng)。試驗(yàn)組自由飲用NaF含量為3.25 g/L的水；對(duì)照組自由飲用自來水（含氟量符合國家標(biāo)準(zhǔn)）。所有試驗(yàn)雞均采用單籠飼養(yǎng)，試驗(yàn)期為80 d。

1.4 取樣及單細(xì)胞懸液的制備

飼養(yǎng)第80天將試驗(yàn)雞剖殺，于4 ℃環(huán)境下取出睪丸，剔除周圍結(jié)締組織，取每羽公雞右側(cè)睪丸采樣，制備單細(xì)胞懸液，用于不同周期細(xì)胞比例的檢測(cè)。剪取大小約為0.5 cm3的睪丸組織塊，用眼科組織剪剪為1～2 mm大小的碎片，置于含3 mL PBS溶液（pH值為7.4）的試管內(nèi)，于渦旋振蕩混合器混合3 min后，用200目尼龍濾網(wǎng)過濾至另一試管內(nèi)。將睪丸組織單細(xì)胞懸液以1 500 r/min離心5 min后棄上清，加入3 mL PBS溶液并混勻1 min，于同樣條件重復(fù)洗滌離心2次即制成單細(xì)胞懸液，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 睪丸組織細(xì)胞周期的測(cè)定

采用流式細(xì)胞儀PI染色法測(cè)定睪丸組織細(xì)胞周期。用PBS溶液沖洗單細(xì)胞懸液2次，將細(xì)胞濃度調(diào)整為106個(gè)/mL，加入75%乙醇于4 ℃固定1 h，使用PBS溶液沖洗2次后，每管依次加入PBS溶液100 μL、PI染液300 μL，置于4 ℃避光環(huán)境中反應(yīng)30 min。采用Epics-prolie型流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期，計(jì)算不同倍體細(xì)胞亞二倍體峰所占的比例。

2 結(jié)果與分析

2.1 鑒定慢性氟中毒試驗(yàn)?zāi)Ｐ?/p>

試驗(yàn)第28天，試驗(yàn)組公雞開始出現(xiàn)雞冠變紫、頭下耷、精神委頓、食欲不振、羽毛粗糙等癥狀；試驗(yàn)第73天左右，試驗(yàn)組大量公雞臥地不起，表明雞慢性氟中毒模型建立成功。

2.2 睪丸組織不同周期細(xì)胞的比例

分別將試驗(yàn)組、對(duì)照組的公雞隨機(jī)均分為6個(gè)小組，每組3羽，計(jì)算各組平均值并比較不同周期細(xì)胞的比例（表1、圖1）。

經(jīng)t檢驗(yàn)，對(duì)于G1期、S期、G2期，試驗(yàn)組與對(duì)照組的差異均極顯著（P<0.01）。

由圖1可知，試驗(yàn)組G1期細(xì)胞比例高于對(duì)照組，而G2期、S期細(xì)胞比例均低于對(duì)照組。由表1可知，試驗(yàn)組G1期與S期細(xì)胞比例呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系，而對(duì)照組則未表現(xiàn)出此關(guān)系。

3 討論與結(jié)論

關(guān)于氟對(duì)細(xì)胞周期的影響已有很多報(bào)道。Sato等采用細(xì)胞培養(yǎng)的方法觀察氟對(duì)二倍體成纖維細(xì)胞周期的影響，發(fā)現(xiàn)氟同步化培養(yǎng)S期細(xì)胞8 h后，DNA合成被抑制[3]。Hayashi等發(fā)現(xiàn)，人二倍體成纖維細(xì)胞各氟染毒組S期細(xì)胞數(shù)明顯高于對(duì)照組[4]。余日安等研究發(fā)現(xiàn)，投氟組S期腎組織細(xì)胞數(shù)明顯增加，G0/G1期、G2/M期細(xì)胞數(shù)無明顯變化[6]。一些學(xué)者則持相反意見。張桂珍等研究小鼠腦、肝、腎等組織并指出，氟對(duì)腦神經(jīng)細(xì)胞的影響主要作用于S期（DNA合成期），它可減少進(jìn)入S期的細(xì)胞數(shù)，從而使S期、G2/M期細(xì)胞數(shù)均減少；氟對(duì)肝細(xì)胞周期的影響主要作用于G1期和G2期，它可使G1期、G2期細(xì)胞數(shù)量顯著增加；過量氟對(duì)腎細(xì)胞周期的作用主要是抑制細(xì)胞凋亡，而當(dāng)氟濃度達(dá)到100 mg/L時(shí)，可引發(fā)睪丸細(xì)胞凋亡[7]。有研究表明，長期飲用氟污染的水將使睪丸間質(zhì)細(xì)胞受到嚴(yán)重?fù)p壞，且血漿睪丸酮會(huì)明顯降低[8-10]。本試驗(yàn)結(jié)論為試驗(yàn)組G1期細(xì)胞比例顯著高于對(duì)照組，G2期、S期細(xì)胞比例顯著低于對(duì)照組，且G1期與S期細(xì)胞比例呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系，這與張桂珍等對(duì)腦組織的研究結(jié)論一致。而本試驗(yàn)結(jié)論與其他學(xué)者的結(jié)論仍存在差異，主要是由試驗(yàn)動(dòng)物及所研究細(xì)胞種類的不同而造成的。以往大多數(shù)試驗(yàn)均在大鼠、小鼠等動(dòng)物機(jī)體中進(jìn)行，或?qū)⒎c作用于人工培養(yǎng)的細(xì)胞，而本研究的試驗(yàn)動(dòng)物則為公雞；其他學(xué)者主要以肝、腎、骨等組織細(xì)胞進(jìn)行試驗(yàn)，而本試驗(yàn)選用的是睪丸組織的生精細(xì)胞，由于睪丸存在血睪屏障，對(duì)氟化鈉的進(jìn)入有一定影響，可能導(dǎo)致試驗(yàn)結(jié)果有差異。張桂珍等的試驗(yàn)部位是小鼠腦部神經(jīng)組織，而存在于腦部的血腦屏障也可對(duì)氟化鈉的進(jìn)入產(chǎn)生影響，這可能是本試驗(yàn)結(jié)論與張桂珍等的結(jié)論一致而不同于其他學(xué)者的主要原因。

氟對(duì)睪丸組織生精細(xì)胞的細(xì)胞周期產(chǎn)生影響，主要通過抑制S期DNA的合成及修復(fù)過程，以影響細(xì)胞從S期到G2/M期過渡的準(zhǔn)備工作，從而使S期細(xì)胞減少，同時(shí)對(duì)S期細(xì)胞進(jìn)入G2期的過程產(chǎn)生抑制作用，并對(duì)細(xì)胞進(jìn)入G1期產(chǎn)生較強(qiáng)的促進(jìn)作用。本研究在細(xì)胞生物學(xué)水平上探討了氟對(duì)睪丸組織生精細(xì)胞產(chǎn)生影響的機(jī)制，為家禽氟病的防治提供理論參考。氟對(duì)動(dòng)物細(xì)胞周期的影響與試驗(yàn)動(dòng)物、組織器官的種類均有關(guān)，氟對(duì)同一動(dòng)物不同組織，或不同動(dòng)物相同、不同組織的影響均可能相同或有差異。

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