徐　晶　張馨芝　張永進(jìn)　李秀明　王　敏　蔡增林　李小民

siRNA干擾SIAH對(duì)細(xì)胞活性和α-synuclein泛素化降解通路的影響*

徐晶①?gòu)堒爸ア購(gòu)堄肋M(jìn)①李秀明①王敏①蔡增林①李小民①

目的：研究siRNA干擾SIAH基因?qū)ι窠?jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞SH-SY5Y細(xì)胞α-synuclein泛素化、降解通路的影響。方法：用熒光標(biāo)記的siRNA-FAM轉(zhuǎn)染SH-SY5Y細(xì)胞后，專(zhuān)業(yè)設(shè)計(jì)合成3條針對(duì)SIAH的siRNA，Western Blot檢測(cè)蛋白水平SIAH表達(dá)的變化，篩選出其中最高效的1條siRNA，用CCK-8法檢測(cè)該siRNASIAH干擾SH-SY5Y細(xì)胞活性；流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)該siRNA-SIAH干擾SH-SY5Y細(xì)胞凋亡的影響；Western Blot檢測(cè)α-synuclein、LC3、E1、P53蛋白水平表達(dá)的變化；qRT-PCR檢測(cè)SIAH、α-synuclein、LC3、E1 mRNA水平表達(dá)的變化；免疫共聚焦分別檢測(cè)SIAH、α-synuclein、LC3共定位情況。結(jié)果：3條siRNA均成功轉(zhuǎn)染SH-SY5Y細(xì)胞，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)siRNA轉(zhuǎn)染SH-SY5Y細(xì)胞轉(zhuǎn)染率89%，Western結(jié)果顯示其中siRNA-2#使細(xì)胞中SIAH蛋白表達(dá)明顯降低，選取該序列進(jìn)行研究。CCK-8法結(jié)果顯示該siRNA干擾SIAH后對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞活增高，流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示該siRNA干擾SIAH可抑制SH-SY5Y細(xì)胞的凋亡，與空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。通過(guò)Western Blot檢測(cè)siRNA-2#組的α-synuclein、LC3、P53蛋白水平，與空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組比較均明顯降低，E1蛋白水平增高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。通過(guò)qRT-PCR檢測(cè)siRNA-2#組的SIAH、α-synuclein、LC3-Ⅱ mRNA水平與空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組比較均明顯降低，而E1的mRNA水平明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論：應(yīng)用siRNA干擾SIAH基因，通過(guò)促進(jìn)泛素-蛋白酶體系統(tǒng)作用減少SH-SY5Y中α-synuclein聚集，SIAH基因有可能成為帕金森病治療中的一個(gè)新靶點(diǎn)。

帕金森?。?E3泛素連接酶； α-synuclein； 泛素化蛋白酶體

First-author's address：Affiliated L ianyungang Hospital of X uzhou Medical College，L ianyungang 222002，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2015.27.001

帕金森病（Parkinson's Dieaese，PD）是阿爾茨海默病后的第二大最常見(jiàn)的神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病，65歲以上的發(fā)病率約1%［1］。它的特點(diǎn)是黑質(zhì)致密部及其他腦干區(qū)域多巴胺能神經(jīng)元變性和丟失，其主要臨床表現(xiàn)為靜止性震顫，運(yùn)動(dòng)徐緩、強(qiáng)直、姿勢(shì)不穩(wěn)定以及其他各種運(yùn)動(dòng)和非運(yùn)動(dòng)功能［2-3］。不管家族性或散發(fā)的帕金森病，其主要病理學(xué)標(biāo)志是以胞質(zhì)內(nèi)α-synuclei聚集物為主的路易小體形成［4］。E3泛素連接酶—SIAH （seven in absentia homolog）能夠使α-synuclein中的賴(lài)氨酸單泛素化，并能夠促進(jìn)其聚集而發(fā)揮對(duì)細(xì)胞的毒性作用［5］。本研究采用siRNA技術(shù)干擾SH-SY5Y細(xì)胞的SIAH活性，從而抑制α-synuclein的單泛素化，阻止細(xì)胞的死亡，為PD的靶向治療尋找有效的調(diào)控靶位，提供新的治療方法。

1　材料與方法

1.1材料 SH-SY5Y細(xì)胞為蘇州大學(xué)神經(jīng)科學(xué)研究所惠贈(zèng)，胎牛血清購(gòu)自Hyclone有限公司，DMEM/ F12購(gòu)自Gibco公司、LipofectamineTM2000購(gòu)自上海Invitrogen公司，CellCountingKit-8（CCK-8）購(gòu)自Dojindo公司，TRNzol試劑、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自Takala公司，引物由英俊科技有限公司設(shè)計(jì)合成，蛋白上樣緩沖液（5X）購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所，BCA蛋白定量試劑盒購(gòu)自美國(guó)Bioworde公司，Marker購(gòu)自Thermo公司。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) 含血清濃度10%的DMEM/F12培養(yǎng)基培養(yǎng)SH-SY5Y細(xì)胞，細(xì)胞培養(yǎng)于6 cm細(xì)胞培養(yǎng)皿中。每2～3天用0.1%的胰酶消化將細(xì)胞傳代，細(xì)胞換液時(shí)加入培養(yǎng)液3 mL/次，培養(yǎng)皿放置于溫度37 ℃、二氧化碳（CO2）濃度為5%的孵箱中培養(yǎng)。

1.2.2SIAHsiRNA的設(shè)計(jì)合成 由蘇州吉?jiǎng)P公司設(shè)計(jì)合成SIAH基因的3條siRNA，siRNA1、siRNA2和siRNA3。序列分別為siRNA1序列：5'-GCUCACAUGUUGUCCAACUTT-3'，其Anti-sense 為5'-AGUUGGACAACAUGUGAGCTT-3'；siRNA2序列：5'-CCUGGUGCUUCCUGUAAAUTT-3'，Antisense 為5'-AUUUACAGGAAGCACCAGGTT-3'；siRNA3序列為5'-GCGACUGUCUAGUCUUUGATT-3'，其Antisense為5'-UCAAAGACUAGACAGUCGCTT-3'。

1.2.3實(shí)驗(yàn)分組與細(xì)胞轉(zhuǎn)染處理 實(shí)驗(yàn)分空白對(duì)照組（即未處理細(xì)胞組）、siRNA干擾組（siRNA-1#組、siRNA-2#組和siRNA-3#組）和陰性對(duì)照組，轉(zhuǎn)染操作按照Invitrogen公司LipofectamineTM2000說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.2.4CCK-8法測(cè)SH-SY5Y細(xì)胞轉(zhuǎn)染SIAH-siRNA后細(xì)胞活性 將細(xì)胞鋪板96孔板，按照上述步驟進(jìn)行轉(zhuǎn)染，置于37 ℃、飽和濕度、5%的CO2條件下常規(guī)培養(yǎng)48 h后，內(nèi)加入10 μL的CCK8/孔，再置于37 ℃孵育2 h。然后直接在酶聯(lián)檢測(cè)儀上450 nm波長(zhǎng)處測(cè)A450值，以A450間接反映細(xì)胞存活數(shù)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，據(jù)公式細(xì)胞存活率=（As-Ab）/（Ac-Ab）×100%計(jì)算存活率，可推算SIAH-siRNA轉(zhuǎn)染后48 h細(xì)胞的存活率。

1.2.5流式法測(cè)SH-SY5Y細(xì)胞轉(zhuǎn)染SIAH-siRNA后細(xì)胞凋亡 采用Annexin-V雙染色檢測(cè)早期凋亡細(xì)胞。用12孔板處理細(xì)胞，每孔接種細(xì)胞1.8×105個(gè)，各組設(shè)計(jì)復(fù)孔3個(gè)。轉(zhuǎn)染同前，siRNA用量為2.5 pmoL/孔，脂質(zhì)體為2.5 μL/孔。轉(zhuǎn)染48 h后終止孵育，經(jīng)消化處理收獲各組細(xì)胞，細(xì)胞在預(yù)冷的PBS中清洗2次，重新離心，去除上清液，再用1×Annexin結(jié)合緩沖液混懸細(xì)胞，測(cè)定細(xì)胞密度，稀釋至1×106個(gè)/mL。取100 μL，加入5 μL Annexin-V和1 μL的100 μg/mL操作液。室溫孵育15 min，加入400 μL的1×Annexin結(jié)合緩沖液，輕輕混合，上機(jī)檢測(cè)。

1.2.6Western Blot法測(cè)SH-SY5Y細(xì)胞轉(zhuǎn)染SIAH-siRNA后蛋白表達(dá)水平 將SH-SY5Y細(xì)胞以1×105/mL種于6孔培養(yǎng)板中，每孔OPI-MEM培養(yǎng)基2 mL，按Lipofectamine2000說(shuō)明書(shū)的條件轉(zhuǎn)染，分3個(gè)組：實(shí)驗(yàn)分空白對(duì)照組（即未處理細(xì)胞組）、siRNA干擾組（siRNA-1#組、siRNA-2#組和siRNA-3#組）和陰性對(duì)照組，轉(zhuǎn)染后6 h，換含10%血清的DMEM/F12新鮮培養(yǎng)液。轉(zhuǎn)染72 h后，獲取細(xì)胞，提取蛋白，蛋白定量，Western blot進(jìn)行蛋白電泳，PVDF膜轉(zhuǎn)膜1.5 h，脫脂牛奶封閉1 h，一抗4度孵育過(guò)夜SIAH （1∶100 SantaCruz America）、α-synuclein（1∶1000 Abcam USA）、LC3（1∶2000 Abcam USA）、E1 （1∶1000，Cell Signaling， USA）、P531∶1000 Abcam USA），用相應(yīng)的HRP標(biāo)記的二抗孵育室溫2 h，ECL反應(yīng)、壓片、顯影、定影，用ImageJ軟件分析系統(tǒng)處理結(jié)果。

1.2.7qRT-PCR法測(cè)SH-SY5Y細(xì)胞轉(zhuǎn)染SIAH-siRNA后mRNA表達(dá)水平 將SH-SY5Y細(xì)胞以5×104/mL種細(xì)胞于12孔培養(yǎng)板中，每孔OPIMEM培養(yǎng)基1 mL，按照Lipofectamine2000說(shuō)明書(shū)的條件轉(zhuǎn)染細(xì)胞，分3個(gè)組：實(shí)驗(yàn)分空白對(duì)照組（即未處理細(xì)胞組）、siRNA干擾組（siRNA-1#組、siRNA-2#組和siRNA-3#組）和陰性對(duì)照組，轉(zhuǎn)染后6 h，換含10%血清的DMEM/F12新鮮培養(yǎng)液。轉(zhuǎn)染后48 h，提RNA，反轉(zhuǎn)錄備cDNA，定量PCR儀上應(yīng)用檢測(cè)SIAH的表達(dá)。SIAH基因cDNA上游引物5'CTGTCGCCCCAAACTTACAT-3'，下游引物5'-CAAGGAGCCTTGCCACTTAC-3'，α-synuclein基因cDNA上游引物5'-CCTCAGCCCAGAGCCTTTC-3'，下游引物5'-CCTCTGCCACACCCTGCTT-3'；LC3基因cDNA上游引物5'-GAGTGGAAGATGTCCGGCTC-3'，下游引物5'-CCAGGAGGAAGAAGGCTTGG-3'；E1基因cDNA上游引物5'-CCCTACATGACCAAGGCACT-3'，下游引物5'-CCAGGAGGAAGAAGGCTTGG-3'；建立Q-PCR反應(yīng)體系，每個(gè)樣品擴(kuò)目的基因和內(nèi)參各3個(gè)重復(fù)。

1.2.8免疫共聚焦法觀察SH-SY5Y細(xì)胞轉(zhuǎn)染SIAH-siRNA后SIAH、LC3、α-synuclein的共定位 將SHSY5Y細(xì)胞以1×105/mL種于共聚焦培養(yǎng)皿中，轉(zhuǎn)染方法同前，轉(zhuǎn)染24 h后PBS沖洗干凈，用4%多聚甲醛固定15 min，棄之，用pbs沖洗10 min×3遍。Trion-X-100打孔20 min，PBS沖洗10 min×3遍。5% 的BSA封閉1 h（37 ℃培箱，BSA用PBS配制），PBS 洗10 min×3遍。一抗孵育4度過(guò)夜SIAH（1∶100 SantaCruz America）、α-synuclein（1∶100 Abcam USA）、LC3（1∶200 Abcam USA），回收一抗，PBS洗10 min ×3遍，二抗孵育37℃ 2 h，PBS洗10 min×3遍，DAPI染10 min，PBS10 min×3遍，用蔡司共聚焦顯微鏡觀察其定位情況。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 使用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料采用（x-±s）表示，多組間比較使用單向方差分析（ANOVA，LSD），以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，PCR結(jié)果利用2-ΔΔCt法統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)。

2　結(jié)果

2.1流式測(cè)轉(zhuǎn)染率用FAM轉(zhuǎn)染SH-SY5Y細(xì)胞6h后，用流式測(cè)轉(zhuǎn)染率，其轉(zhuǎn)染率可達(dá)89%。

2.2siRNA干擾SIAH對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞SIAH蛋白表達(dá)的抑制 轉(zhuǎn)染不同siRNA序列對(duì)SIAH蛋白表達(dá)的影響轉(zhuǎn)染72 h后SIAH蛋白western blot電泳圖，用Image J分析條帶灰度值，并用β-actin做標(biāo)準(zhǔn)化，轉(zhuǎn)染siRNA-1#組、siRNA-2#組、siRNA-3#序列后，轉(zhuǎn)染siRNA-2#組后SIAH蛋白表達(dá)低于陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組，即篩選siRNA-2#組進(jìn)行如下研究。

2.3CCK-8法測(cè)SH-SY5Y細(xì)胞轉(zhuǎn)染SIAH-siRNA后細(xì)胞活性 CCK-8法檢測(cè)轉(zhuǎn)染siRNA-2#序列后與空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組細(xì)胞活性相比，轉(zhuǎn)染SIAH-siRNA 48 h后SH-SY5Y細(xì)胞活性比空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組均有顯著增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而空白對(duì)照組與陰性對(duì)照組之間變化不明顯，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)圖1。

圖1　SIAH-siRNA對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞活力改變

2.4流式法測(cè)SH-SY5Y細(xì)胞轉(zhuǎn)染SIAH-siRNA后細(xì)胞凋亡 流式法檢測(cè)轉(zhuǎn)染siRNA-2#序列后與正常細(xì)胞組和陰性對(duì)照組細(xì)胞凋亡率相比，轉(zhuǎn)染SIAH-siRNA 24 h后SH-SY5Y細(xì)胞凋亡率比空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組均有顯著減少，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而空白對(duì)照組與陰性對(duì)照組之間變化不明顯，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)圖2。

圖2　SIAH-siRNA對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞凋亡改變

2.5Western Blot法測(cè)SH-SY5Y細(xì)胞轉(zhuǎn)染SIAH-siRNA后蛋白表達(dá)水平 與空白對(duì)照組相比，siRNA-2#組的SIAH、α-synuclein、LC3-Ⅱ、P53蛋白水平均下降（t=2.931、3.307、5.506、3.326，P=0.0408、0.0297、0.0053、0.0292，），E1表達(dá)升高（t=3.480，P=0.0254）；與陰性對(duì)照組相比較，siRNA-SIAH組的SIAH、α-synuclein、LC3-Ⅱ、P53蛋白水平均下降（t=5.178、4.851、5.941、4.400，P=0.0066、0.0083、0.0040、0.0117），E1表達(dá)升高（t=3.765，P=0.0197），見(jiàn)圖3～7。

圖3　SIAH-siRNA干擾SH-SY5Y細(xì)胞后SIAH改變

圖4　SIAH-siRNA干擾SH-SY5Y細(xì)胞后LC3-Ⅱ改變

圖5　SIAH1-siRNA 干擾SH-SY5Y細(xì)胞后α-synuclein改變

圖6　SIAH-siRNA干擾SH-SY5Y細(xì)胞后P53改變

圖7　SIAH-siRNA干擾SH-SY5Y細(xì)胞后E1改變

2.6qRT-PCR法測(cè)SH-SY5Y細(xì)胞轉(zhuǎn)染SIAH-siRNA 后mRNA表達(dá)水平 siRNA-SIAH組與空白對(duì)照組相比，SIAH、α-synuclein、LC3-Ⅱ的mRNA水平均下降（t=11.04、16.70、12.98，P＜0.05），E1表達(dá)升高（t=8.739，P=0.0128）；與陰性對(duì)照組相比較，siRNASIAH組的SIAH、α-synuclein、LC3-Ⅱ的mRNA水平均下降（t=6.066、16.58、4.043，P=0.0009、0.0036、0.0040），E1表達(dá)升高（t=9.170，P=0.0117），見(jiàn)圖8。

圖8　SIAH-siRNA干擾SH-SY5Y細(xì)胞后mRNA水平改變

2.7免疫共聚焦法觀察SH-SY5Y細(xì)胞轉(zhuǎn)染SIAH-siRNA 后SIAH、LC3、α-synuclein的共定位 將SIAH-siRNA干擾SH-SY5Y細(xì)胞后，SIAH與α-synuclein的信號(hào)強(qiáng)度減弱，且SIAH與α-synuclein失去共定位，表明干擾SIAH基因能使α-synuclein聚集減少；將SIAH-siRNA干擾SH-SY5Y細(xì)胞后，LC3-Ⅱ與α-synuclein的信號(hào)強(qiáng)度減弱，表明干擾SIAH基因，導(dǎo)致自噬溶酶體成熟障礙。

3　討論

帕金森病的主要病理學(xué)標(biāo)志為黑質(zhì)致密部神經(jīng)體內(nèi)Lewy小體，異常的α-synuclein聚集是Lewy小體的重要組分，因此α-synuclein聚集是帕金森發(fā)生、發(fā)展的一個(gè)中心環(huán)節(jié)［6］。α-synuclein有不規(guī)則聚集體、可溶性寡聚體或者類(lèi)似小纖維三種主要存在形式，而這三個(gè)種類(lèi)都有潛在的神經(jīng)毒性，多數(shù)資料認(rèn)為可溶性寡聚體表現(xiàn)出更大的細(xì)胞毒性而導(dǎo)致神經(jīng)元喪失［7］。在正常神經(jīng)元內(nèi)，α-synuclein的生成與降解之間保持著動(dòng)態(tài)平衡［8］。泛素-蛋白酶體系統(tǒng)（Ubiquitin-proteasome system，UPS）和自噬-溶酶體途徑（Autophagy-lysosome pathway，ALP）是機(jī)體正常修復(fù)或者清除異常蛋白的最主要兩種路徑。蛋白酶體是一桶狀多蛋白復(fù)合體，主要降解短壽的細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)蛋白，然而底物需要展開(kāi)并通過(guò)蛋白酶體圓柱體狹窄的孔隙，這阻礙了低聚物和聚集蛋白的清除［9-10］。自噬是在溶酶體內(nèi)清除細(xì)胞內(nèi)變構(gòu)和錯(cuò)誤折疊的易聚集蛋白，這些蛋白多聚體對(duì)神經(jīng)元有毒性并最終導(dǎo)致神經(jīng)元的死亡，而自噬功能障礙可能是這些蛋白在受損神經(jīng)元內(nèi)積聚的主要原因［8］。研究表明，自噬途徑主要降解不可溶性聚集蛋白，而UPS可以降解可溶性α-synuclein［11-12］。蛋白酶體通路可以清除經(jīng)多聚泛素化后的α-synuclein，體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)研究表明，E3泛素連接酶—SIAH（Seven in absentia homolog）能夠使α-synuclein 中的賴(lài)氨酸泛素化，并能夠促進(jìn)其聚集而對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用［13］。而SIAH所介導(dǎo)的α-synuclein單泛素化形成的聚集體只能通過(guò)自噬途徑降解，因此筆者猜測(cè)可以通過(guò)干擾SIAH功能而減少α-synuclein的聚集及Lewy的形成，為PD的治療提供新的方案。

目前筆者實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明：將siRNA-SIAH轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，細(xì)胞活性增加，細(xì)胞凋亡率減少，可能是SIAH-1蛋白水平下降，P53蛋白水平受抑制，使P53誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡減少，這與文獻(xiàn)［14］報(bào)道結(jié)果是一致的。siRNA-SIAH轉(zhuǎn)染SH-SY5Y細(xì)胞后，SIAH的蛋白水平及mRNA水平均明顯降低，SIAH能使α-synuclein單泛素化并促進(jìn)其聚集從而產(chǎn)生多巴胺神經(jīng)元細(xì)胞毒性［5］。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：抑制SIAH后，蛋白水平上單泛素化α-synuclei降低，mRNA水平也證實(shí)這一點(diǎn)，免疫熒光共聚焦顯微鏡可明顯觀察到α-synuclei的含量減少。因此筆者認(rèn)為，抑制SIAH活性，可以抑制α-synuclein單泛素化及其聚集。干擾SIAH后，自噬泡標(biāo)記物L(fēng)C3-Ⅱ在蛋白水平及mRNA水平上均減少，免疫熒光共聚焦顯微鏡也證實(shí)了這一點(diǎn)。因此，干擾SIAH活性，可能引起自噬活性減低。然而，干擾SIAH后，E1的表達(dá)在蛋白水平及mRNA水平上都增加，使UPS通路活性增加。SIAH介導(dǎo)的α-synuclein單泛素化的聚集及多巴胺神經(jīng)元內(nèi)形成聚集物［15］。所以，筆者認(rèn)為，抑制SIAH的活性，能抑制α-synuclein的單泛素化及其聚集，使得單體水平增加，這些單體通過(guò)UPS通路而不是自噬通路降解。

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Effect of siRNA Interference SIAH on Cell Activity and α-synuclein Ubiquitin Degradation Pathway

/XU J ing，ZHANG Xin-zhi，ZHANG Yong-jin，etal.//Medical Innovation of China，2015，12（27）：001-005

Objective：To study the effect of siRNA-SIAH on α-synuclein autophagy and UPS degradation in SH-SY5Y.Method：After transfection of siRNA-FAM cells with fluorescent labeled SH-SY5Y， 3 siRNA were professional designed for SIAH，the protein level of SIAH expression was measured by Western Blot， one of the most efficient siRNA was selected.CCK-8 assay was used to detect the activity of siRNA-SIAH in SH-SY5Y cells. Flow cytometry was used to detect the apoptosis of siRNA-SIAH in SH-SY5Y cells.Western Blot was used to detect the protein level expression ofα-synuclein，LC3，E1，and P53.qRT-PCR was used to detect the level of mRNA in SIAH，α-synuclein，LC3 and E1. Confocal microscopy was used to detect the positioning of SIAH，α-synuclein and LC3-Ⅱ.Result： 3 siRNA cells successfully transfected SH-SY5Y，the transfection efficiency was 89%. The Western results showed that the expression of SIAH was significantly decreased in siRNA-2# cells， then studied this sequence. CCK-8 assay showed that the SH-SY5Y cell activity increased after siRNA interference， and the flow cytometry results showed that siRNA could inhibit the apoptosis of SH-SY5Y cells， which was significantly different from the control group and the negative control group（P＜0.05）.With Western Blot method，the protein levels of α-synuclein， LC3 and P53 in siRNA-2# group were significantly lower and E1 was higher than that in control group and negative control group， the differences were statistically significant（P＜0.05）.With qRT-PCR method，the mRNA level of SIAH，α-synuclein and LC3-Ⅱ mRNA in siRNA-2# group were significantly lower and E1 was higher than that in control group and negative control group，the differences were statistically significant（P＜0.05）.Conclusion： Using siRNA to interfere with SIAH gene， SIAH gene can be used as a new target in the treatment of Parkinson's disease by promoting the ubiquitin proteasome system to reduce SH-SY5Y in α-synuclein.

Parkinson's disease； Seven in absentia homolog（SIAH）； α-synuclein； Ubiquitin-proteasome system

江蘇省自然基金面上項(xiàng)目（BK2011402）

①徐州醫(yī)學(xué)院附屬連云港醫(yī)院 江蘇 連云港 222002

李小民

（2015-06-03） （本文編輯：周亞杰）