凌永昌　劉　翔　張　瑩　劉新征　李年生

贛州市唇腭裂孕婦血漿代謝組學(xué)的初步分析*

凌永昌①劉翔①?gòu)埇摙賱⑿抡鳍倮钅晟?/p>

目的：探討唇腭裂孕婦血漿代謝組學(xué)特點(diǎn)，為臨床早期檢測(cè)唇腭裂胎兒提供診斷依據(jù)。方法：選取2014年2月-2015年4月本院產(chǎn)前超聲篩查診斷胎兒為唇腭裂的孕婦21例作為病例組，隨機(jī)選取同期本院產(chǎn)前篩查診斷胎兒為正常的孕婦21例作為對(duì)照組，采用基于核磁共振（NMR）的代謝組學(xué)技術(shù)分別檢測(cè)并比較兩組孕婦血漿代謝組學(xué)特點(diǎn)。結(jié)果：病例組血漿代謝產(chǎn)物與對(duì)照組有顯著差異，病例組患者血漿中苯丙氨酸、纈氨酸和酪氨酸含量高于對(duì)照組，而丙氨酸、膽堿、磷酰膽堿代謝產(chǎn)物較對(duì)照組含量降低。結(jié)論：基于NMR代謝組學(xué)技術(shù)可較好反映唇腭裂胎兒孕婦血漿代謝變化，能獲得相應(yīng)特征代謝物，有重要臨床應(yīng)用前景。

唇腭裂； 孕婦； 血漿； 代謝組學(xué)

First-author's address：The First Affiliated Hospital of Gannan Medical University，Ganzhou 341000，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2015.27.004

唇腭裂為常見(jiàn)先天性顏面部畸形疾病，在胚胎發(fā)育至6～12周時(shí)，外胚間質(zhì)細(xì)胞不能正常增生、分化、凋零、退變，導(dǎo)致面（腭）突融合障礙而形成唇部和腭部裂隙，為顱面先天發(fā)育畸形之一，影響生活質(zhì)量［1］。臨床中三維超聲在孕期對(duì)胎兒唇腭裂有早期診斷價(jià)值，但受羊水、胎兒體位及操作手法等影響，存在一定誤診、漏診率。代謝組學(xué)通過(guò)檢測(cè)機(jī)體生物標(biāo)本，反映機(jī)體病理生理及基因改變，為近年來(lái)發(fā)展的新興技術(shù)，在臨床疾病診斷、病理學(xué)及中藥療效中有重要應(yīng)用價(jià)值［2-3］。唇腭裂與多因素遺傳有相關(guān)性，且與孕期吸煙、用藥等因素有關(guān)［4-5］。本研究探究了基于NMR代謝組學(xué)技術(shù)在唇腭裂孕婦血漿代謝組學(xué)中的檢查效果，現(xiàn)具體報(bào)道如下。

1　資料與方法

1.1一般資料 選取2014年2月-2015年4月本院產(chǎn)前超聲篩查診斷胎兒為唇腭裂的孕婦21例作為病例組，隨機(jī)選取同期本院產(chǎn)前篩查診斷胎兒為正常的孕婦21例作為對(duì)照組。病例組年齡22～42歲，平均（29.8±4.2）歲；孕周17～29周，平均（22.4±3.4）周。對(duì)照組年齡21～41歲，平均（29.6±4.1）歲；孕周18～31周，平均（22.5±3.6）周。兩組年齡、孕周等一般資料比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。

1.2入組標(biāo)準(zhǔn) （1）病例組孕婦產(chǎn)前經(jīng)超聲檢查胎兒明確診斷為唇腭裂，排除合并妊娠疾病的孕婦和胎兒；（2）排除孕婦家屬患有Robbin綜合征者或Shprintzen綜合征等綜合征性唇腭裂的孕婦；（3）排除合并有先天性代謝缺陷疾病的孕婦；（4）排除有血液系統(tǒng)疾病或臨床生化結(jié)果異常者；（5）排除合并有傳染病如肝炎、獲得性免疫缺陷綜合征等的患者。

1.3方法

1.3.1血漿樣本采集 所有研究對(duì)象空腹6 h以上后次日清晨抽取空腹靜脈血送檢驗(yàn)科檢查。抽取全血4 mL置入一次性靜脈采血器抗凝管中，以1500 r/min速度離心15 min，后取2 mL上清液置入去酶EP管內(nèi)，采用渦旋混勻器快速混勻1 min，在4 ℃溫度下以14 000 r/min速度離心15 min，取1.5 mL上清液置入EP管內(nèi)，并立即存入-20 ℃低溫冰箱中待用。

1.3.2樣本預(yù)處理 室溫下解凍樣本，將EP管依次編號(hào)，分別在關(guān)內(nèi)加入600 μL樣本液和300 μL重水，以快速渦旋混勻器震蕩混勻30 s后靜置10 min，在4 ℃溫度下以14 000 r/min轉(zhuǎn)速離心5 min，取上清液500 μL加入直徑為5 mm核磁共振管中，待NMR分析。

1.3.3圖譜和數(shù)據(jù)處理與獲得 采用NMR方法分析，測(cè)量?jī)x器采用INOVA-400MHZ型超導(dǎo)核磁共振波譜儀，獲得兩組患者血漿一維1H NMR譜圖。在室溫條件下，在NMR波譜儀上調(diào)整Presat脈沖序列，調(diào)整脈沖為45。，用預(yù)飽和方式抑制水峰，調(diào)整觀測(cè)頻率為399.89 Hz，弛豫時(shí)間為1 s，預(yù)飽和時(shí)間為2 s，譜寬5218.2 Hz，采樣點(diǎn)數(shù)64 k，采樣時(shí)間為3.744 s，疊加次數(shù)128次，儀器的分辨率為0.45 Hz，靈敏度為450∶1，預(yù)飽和頻率和中心頻率為水峰位置。獲取樣本的波譜圖，即原始自由感應(yīng)衰減信號(hào)數(shù)據(jù)。將所有樣本的NMR數(shù)據(jù)導(dǎo)入MESTRE-v4.7軟件中進(jìn)行分析，調(diào)節(jié)FID信號(hào)32 k傅立葉變換后，獲取1H NMR圖譜。將定位TMS峰為δ0.00，對(duì)所獲圖譜進(jìn)行基線(xiàn)和相位校正后，確定NMR譜化學(xué)位移，對(duì)δ0～4.52、δ6～10區(qū)域譜峰者，每段按照Δ6=0.04 ppm將譜圖分解成212個(gè)區(qū)域，后進(jìn)行分段積分，獲得各個(gè)化學(xué)位移值段所對(duì)應(yīng)積分值。光譜采集所有樣本，獲得血漿數(shù)據(jù)，并將其構(gòu)成n x d二維矩陣。將積分?jǐn)?shù)據(jù)統(tǒng)一后，用Excel或文本方式儲(chǔ)存。采用SIMCA-P11.0軟件對(duì)PCA進(jìn)行分析，求出主成分，血漿的代謝組成分采用PC進(jìn)行分析。所得分析結(jié)果使用載荷圖和得分圖表示。載荷圖反映所有積分段對(duì)樣本主成分得分值貢獻(xiàn)，與得分圖進(jìn)行結(jié)合分析獲得組間分布差異，并分析出此差異對(duì)積分段貢獻(xiàn)；結(jié)合1H NMR譜圖與所對(duì)應(yīng)化學(xué)位移值進(jìn)行對(duì)應(yīng)后即可確定相應(yīng)的代謝物，從而分析出樣品中某些代謝物的變化和其可能意義。得分圖通常采用各樣本在前2個(gè)主成分坐標(biāo)系中的值來(lái)表示，反映樣本之間的分布關(guān)系，從中可以得出各組樣本之間的差異。通過(guò)對(duì)OPLS-DA進(jìn)行分析，得出所有代謝物相應(yīng)的相關(guān)系數(shù)，將有統(tǒng)計(jì)意義代謝物統(tǒng)一進(jìn)行歸納。在相關(guān)系數(shù)圖中，將每一個(gè)變量的標(biāo)準(zhǔn)偏差的平方根值與loading值相乘后對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行回溯轉(zhuǎn)換。將轉(zhuǎn)化結(jié)果與相應(yīng)相關(guān)系數(shù)臨界值表進(jìn)行對(duì)比，獲得引起組間差異的代謝物。

2　結(jié)果

2.1兩組血漿1H NMR圖譜對(duì)照比較 將唇腭裂胎兒孕婦和正常胎兒孕婦血漿1H NMR核磁代謝圖譜放大16倍并進(jìn)行疊加比較，波譜顯示兩組樣品在δ0.5～5.5 和δ5.5～9.0的化學(xué)位移處存在差異波峰，見(jiàn)圖1。

圖1　兩組血漿樣品1H NMR圖譜變化

2.2主成分分析 為分析各血漿樣本間關(guān)系，將校正后的數(shù)據(jù)做PCA分析。PCA是可以將分散在一組變量上的代謝圖譜信息集中到某幾個(gè)綜合指標(biāo)上的統(tǒng)計(jì)分析方法，利用主成分分析機(jī)體代謝的變化特征。采用SIMCA-P+軟件（V11.0， Umetrics AB， Umea， Sweden）對(duì)歸一化后的數(shù)據(jù)進(jìn)行模式識(shí)別多變量分析，PCA采用中心化換算（mean center scaling，Ctr）的數(shù)據(jù)標(biāo)度換算方式，見(jiàn)圖2。

圖2　基于兩組血漿樣本1HMR圖譜主成分分析

2.3組間差異代謝物統(tǒng)計(jì) 病例組患者血漿中苯丙氨酸、纈氨酸和酪氨酸含量高于對(duì)照組，而丙氨酸、膽堿、磷酰膽堿代謝產(chǎn)物較對(duì)照組含量降低，見(jiàn)表1。

表1　兩組代謝產(chǎn)物差異統(tǒng)計(jì)

3　討論

唇腭裂為先天性發(fā)育畸形疾病，為母體及胎兒在受到多種影響因素下引起的發(fā)育畸形，對(duì)胎兒正常生長(zhǎng)發(fā)育、生活、學(xué)習(xí)有重要影響。唇腭裂患兒出生后對(duì)其語(yǔ)言、聽(tīng)覺(jué)、外觀及心理造成嚴(yán)重影響，可對(duì)健康、社會(huì)融合造成長(zhǎng)期不良后果［6-8］。在妊娠過(guò)程中及時(shí)發(fā)現(xiàn)唇腭裂胎兒，早期進(jìn)行干預(yù)可降低唇腭裂出生率，對(duì)提高生育質(zhì)量有重要幫助［9］。臨床中尋找有效早期診斷標(biāo)志至關(guān)重要，三維超聲為目前臨床中妊娠期診斷唇腭裂有效、經(jīng)濟(jì)、無(wú)創(chuàng)、便捷的輔助手段，常規(guī)在妊娠16～27周進(jìn)行檢查，通過(guò)直接觀察胎兒發(fā)育狀況判定是否患有唇腭裂［10］。但長(zhǎng)期臨床實(shí)踐發(fā)現(xiàn)，超聲在檢查過(guò)程中胎兒位置變動(dòng)、羊水過(guò)少、孕周過(guò)大或過(guò)小及超聲操縱人員手法不一等多種因素均可影響獲得胎兒面部滿(mǎn)意三維容積圖像，因此會(huì)造成誤診、漏診或診斷不清［11］。

代謝組學(xué)為新興技術(shù)是通過(guò)考察生物體系受刺激或擾動(dòng)后（如某個(gè)特定的基因變異或環(huán)境變化后）其代謝產(chǎn)物本身的改變或隨時(shí)間的變化，來(lái)研究生物體系的代謝途徑的一種技術(shù)［12］。與基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)相對(duì)應(yīng)，代謝組學(xué)是一門(mén)對(duì)某一生物或細(xì)胞所有低分子量代謝產(chǎn)物進(jìn)行定性和定量分析，以監(jiān)測(cè)活細(xì)胞中化學(xué)變化的科學(xué)［13］。代謝組學(xué)通過(guò)對(duì)某一生物或細(xì)胞所有低分子量代謝產(chǎn)物進(jìn)行定量或定性分析，檢測(cè)機(jī)體體液、細(xì)胞提取物、細(xì)胞培養(yǎng)液及組織代謝物質(zhì)變化，通過(guò)生物信息、化學(xué)計(jì)量學(xué)、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析從而發(fā)現(xiàn)其內(nèi)在聯(lián)系，發(fā)現(xiàn)在特定疾病中代謝組學(xué)特征，從而獲得診斷依據(jù)［14］。

唇腭裂發(fā)生受母體遺傳和環(huán)境影響，基于NMR代謝組學(xué)技術(shù)對(duì)生物液體檢測(cè)可達(dá)到正常生理水平，獲得具有特征代謝指紋圖譜，通過(guò)對(duì)比分析特征性代謝組學(xué)，為整體研究母體代謝在畸形發(fā)生過(guò)程中的變化提供了有效手段［15］。有研究提示，先天性唇腭裂患者和正常人的血漿代謝存在差異，運(yùn)用代謝組學(xué)技術(shù)可以早期篩查唇腭裂疾病并探討其代謝機(jī)制，同時(shí)表明在此基礎(chǔ)上推斷其潛在的發(fā)病具有一定可行性［16-17］。本次研究將超聲明確診斷為唇腭裂孕婦血漿代謝組學(xué)與正常孕婦進(jìn)行對(duì)比分析，結(jié)果得出兩者血漿代謝產(chǎn)物存在顯著差異，病例組患者血漿中苯丙氨酸、纈氨酸和酪氨酸含量高于對(duì)照組，而丙氨酸、膽堿、酰膽堿代謝產(chǎn)物較對(duì)照組含量降低。這些差異特征代謝產(chǎn)物可能為唇腭裂胎兒生物學(xué)標(biāo)記，為以后臨床通過(guò)血漿代謝組學(xué)檢測(cè)診斷唇腭裂提供有效依據(jù)。苯丙氨酸和纈氨酸均為人體必須氨基酸，纈氨酸可作用于黃體、乳房、卵巢，維持神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)揮正常作用。苯丙氨酸主要作用于人體神經(jīng)中樞，確保神經(jīng)、體液等各項(xiàng)調(diào)節(jié)正常。丙氨酸為人體非必須氨基酸，但在人體中發(fā)揮重要作用，可協(xié)助機(jī)體將葡萄糖轉(zhuǎn)化為能量，同時(shí)還能協(xié)助人體肝臟對(duì)各種毒素進(jìn)行清除，為機(jī)體提供大量能量。膽堿為有機(jī)堿，為卵磷脂合成主要成分，同時(shí)在神經(jīng)鞘內(nèi)廣泛存在，為人體甲基產(chǎn)物組成成分，同時(shí)為乙酰膽堿前體。研究指出，膽堿可促進(jìn)人體機(jī)體、大腦發(fā)育，具有調(diào)控細(xì)胞凋亡、完成信息傳導(dǎo)、提高人體記憶力等功效［18］。唇腭裂患兒母體上述成分出現(xiàn)異?？赡芎图膊“l(fā)生有一定相關(guān)性。有學(xué)者研究指出，在腭胚突發(fā)育過(guò)程中母體環(huán)境與胚胎環(huán)境是緊密相關(guān)的，胚胎代謝異常會(huì)引起母體代謝的異常變化，兩者之間存在有互動(dòng)的關(guān)系［19］。表明唇腭裂胎兒代謝與母體有特定相關(guān)性，通過(guò)檢測(cè)孕婦血漿代謝組學(xué)，分析特有特征對(duì)臨床診斷妊娠期唇腭裂疾病有重要意義。

綜上所述，基于核磁共振的代謝組學(xué)技術(shù)可較好獲得妊娠唇腭裂孕婦血漿代謝產(chǎn)物，通過(guò)分析代謝組學(xué)特征可為臨床提供診斷唇腭裂的有效方法，在未來(lái)臨床中具有較廣泛的應(yīng)用價(jià)值。

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Preliminary Analysis of Metabonomics of Pregnant Women with Cleft Lip and Palate Fetus in Ganzhou City

/LING Yong-chang，LIU Xiang，ZHANG Ying，etal.//Medical Innovation of China，2015，12（27）：012-015

Objective：To investigate the metabonomics features of pregnant women with cleft lip and palate fetus in order to provide diagnostic evidences for the early detection of fetus with cleft lip and palate.Method：21 pregnant women who were diagnosed with cleft lip and palate fetus through prenatal ultrasound screening in our hospital from February 2014 to April 2015 were selected as the case group，21 normal pregnant women who received the prenatal ultrasound screening in our hospital were randomly selected as the control group at the same time.The metabonomics features of the two groups were detected through metabonomics technology based on the nuclear magnetic resonance （NMR）.The metabonomics features of the two groups were compared.Result：The plasma metabolites of the two groups were significantly different.The contents of phenylalanine，valine and tyrosine in the case group were higher than those in the control group.The contents of alanine，choline and phosphorylcholine in the case group were lower than those in the control group.Conclusion：NMR-based metabonomics can well reflect the metabolic changes in pregnant women with cleft lip and palate fetus.It can obtain corresponding metabolites features and has important clinical application prospect.

Cleft lip and palate； Pregnant women； Plasma； Metabonomics

江西省衛(wèi)生廳科技計(jì)劃（20141116）

①贛南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院 江西 贛州 341000

凌永昌

（2015-06-11） （本文編輯：王利）