李適云++何裕堅++張宏濤

摘 要：本文通過細致分析與探究微板吸光法用于測定環(huán)境毒物對藻生長的抑制效應，指出微板吸光法是1種以微藻為指示生物，置于96孔板培養(yǎng)，用酶標儀連續(xù)測定其吸光度，從而評價毒物毒性的方法。大量試驗成果可證實該法具有所需樣品量少、易于設置多濃度、節(jié)約時間、與標準錐形瓶法有良好一致性等優(yōu)點，是1種切實可行的檢測方法。因此，隨著社會的發(fā)展，環(huán)境樣品和有毒化學品檢測數(shù)目的極速增長，該法仍具有繼續(xù)擴大基礎研究，強化實際應用性能的意義。

關鍵詞：微板吸光法；毒性試驗；生態(tài)毒理；藻類；酶標儀

中圖分類號：X55 文獻標識碼：A DOI：10.11974/nyyjs.20150733001

藻類是水體的初級生產者，對維持水生生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定性起著十分重要的作用。此外，藻類繁殖快，個體小，對環(huán)境毒物敏感，容易在實驗室條件下培養(yǎng)。因此，評價污水、農藥等環(huán)境樣品的生態(tài)毒性時都把藻類生長抑制效應作為標準毒性測試方法，如經濟合作與發(fā)展組織OECD和中國國家環(huán)境保護總局[2]等。但標準測試法一般都用錐形瓶作為藻類培養(yǎng)的容器，進行試驗時，存在樣品體積大、工作量大、試驗條件難以維持一致等缺點。隨著環(huán)境樣品檢測數(shù)目的增加，亟須找到一種高效便捷的測試方法。

1 微板吸光法的概述

細胞計數(shù)法、可見分光光度法、熒光分光光度法和葉綠素a含量測定法是目前測定微藻生長情況的基本方法 [2]。據(jù)報道，對不同培養(yǎng)時間、不同生理狀態(tài)的微藻進行光譜掃描也能獲得一致的吸收峰，其測得的光密度值（OD值）與細胞計數(shù)密度值具有良好的線性擬合相關性，表明可見分光光度法可用來真實反映微藻在培養(yǎng)過程中的生長情況[3]。可見分光光度法憑借其方便快捷、重復性、準確性等特點而被廣泛使用。同時結合酶標儀多孔自動化檢測性能，1種高效新型的測定方法應運而生——微板吸光法。微板吸光法已常用于微生物的毒性試驗中，進而讓微板吸光法作為藻類生長抑制試驗的測試手段奠定了堅實的理論基礎。

2 微板吸光法的特點

縱觀國內外學者利用微板吸光法進行的藻類毒性試驗，可總結出以下特點：PAIX?O等[4]將微板法與錐形瓶法進行比較，發(fā)現(xiàn)其試驗結果比較一致；孫禾琳等[5]用微板吸光法對多鐘持久性有機污染物（POPs）進行毒性評價，證實微板吸光法所需樣品量少，成本降低，可以快速測定微藻的毒性；SATOH等[6]也用該法測試了Cu，As，Sb，Pb和Cd對9種微藻的毒性，表明該種方法對多種藻類都適用，且方便設置多個平行和多個濃度；Geis等證明微板試驗操作簡單，節(jié)省時間，降低平行測定的變異，顯著提高空白試驗的重復性。

3 微板吸光法應用于藻類毒性試驗

3.1 測定藻類生長抑制效應

先摸索藻類在微板吸光法中的最佳波長、pH、暴露時間等條件，將藻種進行活化和多次預培養(yǎng)，使其在合適的條件下長至對數(shù)生長期，試驗前1～2d轉接藻種至新鮮培養(yǎng)基，待其OD值為0.10左右備用。為了防止邊緣效應的產生，在96孔板的四周36個孔中加入250μL去離子水[7]；空白對照組的孔加入100μL去離子水和150μL藻液；試驗組的孔加入100μL受試物試驗液和150μL藻液。向微板加透明蓋后置于適宜的條件下培養(yǎng)，在試驗的0h、24h、48h、72h振蕩微板5s，將其放入酶標儀中，測定微藻的OD值。對濃度-效應曲線進行擬合，即可算出半數(shù)抑制濃度EC50及95%置信區(qū)間[8]。

3.2 用于農藥高通量篩選的研究

新農藥的研發(fā)需要合成篩選上萬個化合物，以常規(guī)的溫室盆栽法和培養(yǎng)皿法作為初篩法，是很難在短時間內完成的。微板吸光篩選法不僅能縮小測試規(guī)模，而且農藥用量少、篩選速度也快。對于一些只能得到微克級的農藥，微板吸光法更簡單易行。嚴航貞等[9]提出用該法測定除草劑活性，并與標準錐形瓶法的結果作比較，得出二者結果相符，證實微板吸光法可作為農藥高通量篩選的1個備選方法。

4 目前還存在的問題

由于微板孔體積很小，需要考慮測試載體、光照均勻性、蒸發(fā)量等條件對藻毒性試驗結果的影響，但關于上述影響因素的系統(tǒng)研究卻很少；個別微板吸光法的結果擬合系數(shù)較低，需提高試驗的重復性，進一步優(yōu)化試驗方法；微板的材質、試驗中振蕩頻率不足，會導致藻類容易沉降或黏附在微板壁上，測得OD值偏低；微板孔中添加藻液和受試物的量都較少，易產生誤差，因此在試驗中要盡量設置多個平行及濃度；對于一些顏色較深的試驗樣品，有可能會導致 OD值偏高 [10]，進而影響微板吸光法的準確性。

5 結 語

雖然，目前有實際的應用問題仍需解決，微板吸光法測定藻毒性的試驗條件還不夠成熟，但該法在投入更少成本、時間、用量的情況下，卻能處理更多樣品、便于多濃度多平行測試，適合測試量少的環(huán)境樣品、新型化合物和昂貴化學品。這使得擴大微板法測試范圍的基礎研究，強化微板吸光法的實際應用性能已勢在必行。

參考文獻

[1] 國家環(huán)境保護總局.水和廢水監(jiān)測分析方法[M].北京：中國環(huán)境科學出版社（第四版），2002：715-721.

[2] 戴榮繼，黃春，佟斌等.藻類葉綠素及其降解產物的測定方法[J]. 中央民族大學學報（自然科學版），2004，13（1）：75-80.

[3] 涂波，曹敏，黃茜等.分光光度法與顯微計數(shù)法測定微小綠藻生物量的比較研究[J]. 西南大學學報（自然科學版），2014，36（8）：44-50.

[4] PAIX?O S，SILVA L，F(xiàn)ERNADES A，et al. Performance of a miniaturized algal bioassay in phytotoxicity screening[J]. Ecotoxicology，200817（3）：165-171.

[5] 孫禾琳，蔡恒江，姚子偉.微板法測試12種POPs對新月菱形藻的毒性[J].海洋科學進展，2011，29（4）：529-536.

[6] 劉保奇，葛會林，劉樹深.測定環(huán)境污染物對青海弧菌發(fā)光強度抑制的微板發(fā)光法研究[J].生態(tài)毒理學報，2006，1（2）：186-191.

[7] 袁靜，劉樹深，王麗娟等.蛋白核小球藻（Chlorella pyrenoidosa）微板毒性分析方法優(yōu)化[J].環(huán)境科學研究，2011，24（5）：553-558.

[8] 葛會林，劉樹深，朱祥偉等.微板吸光法測定9種農藥對斜生柵藻的抑制毒性[J].生態(tài)毒理學報，2008，3（6）：606-612.

[9] 嚴航貞，張安平，林春綿.96孔板法用于除草劑高通量篩選的研究[J].浙江工業(yè)大學學報，2009，37（2）：119-122.

[10] 胡先文，董元彥，張新萍等.可見分光光度法測定水華魚腥藻[J]. 華中農業(yè)大學學報，2002，21（3）：295-297.

作者簡介：李適云（1987-），女，廣東佛山人，華南農業(yè)大學本科生，從事研究生態(tài)毒理方面的工作。