陳舟

摘 要：為高效完成小麥中嘔吐毒素的精準(zhǔn)檢測，本文通過多維度實驗對高效液相色譜儀、酶標(biāo)儀和真菌毒素快速檢測儀檢測小麥中嘔吐毒素處理過程和檢測數(shù)據(jù)進(jìn)行對比分析，3種設(shè)備檢驗操作過程中各有優(yōu)劣，檢測結(jié)果能滿足不同需求?？鞕z儀適合快速定性篩查，酶標(biāo)儀可用于高通量檢測，高效液相色譜儀可進(jìn)行精準(zhǔn)檢測和定量復(fù)核。綜合分析得出，在實際應(yīng)用中，3種設(shè)備可以配合使用，相互補充，靈活運用各種設(shè)備優(yōu)勢，可高效完成各種檢測需求。

關(guān)鍵詞：高效液相色譜儀;酶標(biāo)儀;快檢儀;嘔吐毒素;小麥

嘔吐毒素，又名為脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（DON），主要由禾谷鐮刀菌和黃色鐮刀菌產(chǎn)生，是一種全球性的污染谷物的霉菌毒素之一，通常在小麥、大麥、燕麥、玉米等谷物及其制品中最為常見。DON超標(biāo)攝入會導(dǎo)致人畜厭食、嘔吐、腹瀉、發(fā)燒、站立不穩(wěn)和反應(yīng)遲鈍等急性中毒癥狀，嚴(yán)重時會導(dǎo)致組織壞死和內(nèi)臟出血，甚至死亡[1]。正因為DON對人類的生命健康有很大的威脅，我國對小麥中的DON含量制定了嚴(yán)格的限量標(biāo)準(zhǔn)。

當(dāng)前，我國檢測機構(gòu)針對小麥中的DON檢測設(shè)備有很多種，但涉及檢測原理主要有串聯(lián)質(zhì)譜法、高效液相色譜法、薄層色譜測定法、酶聯(lián)免疫吸附篩查法、膠體金紙層析免疫法等。在DON檢測中根據(jù)不同的需求，選擇不同的設(shè)備和方法來檢測，對于檢測效率至關(guān)重要，因此，本文通過實驗對高效液相色譜儀、酶標(biāo)儀、真菌毒素快速檢測儀3種設(shè)備檢測小麥中DON的優(yōu)劣進(jìn)行對比分析。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

LC-20A高效液相色譜儀、SPD-20A紫外檢測器，島津;Model-680酶標(biāo)儀，美國伯樂;ROSA-M快檢儀，美國CHARM;TLE204E/02電子天平，梅特勒-托利多;PHC-11D氮吹儀，月旭科技（上海）;HY-4振蕩器，金壇市大地自動化儀器;800D離心機，常州普天儀器;DON免疫親和柱，安譜（CNW）;Deoxynivalenol標(biāo)準(zhǔn)品，安譜（ANPEL）;DON檢測試劑盒，芬德生物（SZ FINDE）;ROSA DON快檢試劑條，美國CHARM。

DON質(zhì)控樣-1、DON質(zhì)控樣-2，國家糧食和物資儲備局科學(xué)研究院;甲醇（色譜純）;聚乙二醇（生化試劑）;氯化鈉（分析純）;磷酸氫二鈉（分析純）;磷酸二氫鉀（分析純）;氯化鉀（分析純）;鹽酸（優(yōu)級純）;去離子水。

1.2 樣品前處理

1.2.1 高效液相色譜儀

稱取25 g樣品于100 mL具塞三角瓶，加5 g聚乙二醇，加水100 mL，混勻，振蕩20 min。以玻璃纖維濾紙過濾至澄清，移取濾液2.0 mL，以1滴/s流速過免疫親和柱，再分別用5 mL PBS緩沖鹽溶液和水先后淋洗，棄去流出液，抽干小柱。加2 mL甲醇洗脫親和柱，下滴速度1滴/s，收集洗脫液，50 ℃下氮氣緩緩吹至近干，最后加入1.0 mL初始流動相，渦旋30 s溶解，0.45 μm濾膜過濾，取濾液入進(jìn)樣小瓶待上機檢測。

1.2.2 酶標(biāo)儀

稱取5.0 g粉碎樣品于50 mL離心管，加入20 mL去離子水，振蕩5 min，室溫4 000 r/min離心10 min;靜置分層，取0.1 mL上清液，加入0.9 mL復(fù)溶液，混勻，待測。

1.2.3 DON快速檢測儀

準(zhǔn)確稱量5.0 g粉碎樣品于50 mL的離心管，加入25 mL

的去離子水，渦旋振蕩1 min，靜置1 min，取1 000 μL上清液于1號離心管中，放入離心機5 000 r/ min，離心1 min后，從中取100 μL樣品提取液和1 000 μL嘔吐毒素稀釋緩沖液（DONQ）放入2號離心管，渦旋振蕩10 s，待測。

1.3 上機檢測

1.3.1 高效液相色譜儀

高效液相色譜儀設(shè)置紫外檢測器，色譜柱：XB-C18（4.6? mm×150 mm，5 μm），其余色譜條件參考GB 5009.111—2016[2]。

1.3.2 酶標(biāo)儀

加標(biāo)準(zhǔn)品和樣品50 μL/孔到對應(yīng)微孔中，然后加抗體工作液50 μL/孔，輕輕震蕩5 s混勻，37 ℃避光反應(yīng)30 min。

洗板：甩干孔中液體，用工作洗滌液350 μL/孔充分洗滌5次，每次間隔30 s，最后用吸水紙拍干。加酶標(biāo)記物

100 μL/孔，37 ℃避光反應(yīng)30 min。再次洗板（同上）。顯色：加底物A 50 μL/孔，再加底物B 50 μL/孔，輕輕振蕩5 min混勻，37 ℃避光顯色15 min。終止：加入終止液50 μL/孔，

輕輕振蕩混勻，終止反應(yīng)。酶標(biāo)儀于450 nm（建議雙波長450/630 nm）處上機測定每孔OD值。

1.3.3 DON快速檢測儀

讀數(shù)儀調(diào)至DON-00檔。取嘔吐毒素快檢試劑條（綠色），將其反面放入孵育器中，膠紙撕開至黑線處，取300 μL待測稀釋液，緩慢加入試劑條凹槽中后蓋上膠紙，45 ℃下孵育5 min后，插入讀數(shù)儀測定讀數(shù)。

1.4 儀器檢測原理對比

（1）高效液相色譜儀（紫外檢測器）。利用物質(zhì)在色譜柱流動相與固定相之間有不同的分配量，進(jìn)行DON分離，不同濃度的DON在紫外檢測器引起不同響應(yīng)值進(jìn)而輸出不同峰形，最后用外標(biāo)法定量。

（2）酶標(biāo)儀篩查原理?；诳乖贵w間接競爭反應(yīng)技術(shù)，DON和酶標(biāo)板上的預(yù)包被偶聯(lián)抗原競爭抗嘔吐毒素抗體，標(biāo)記后用TMB底物顯色，樣本吸光度值與其所含DON量成負(fù)相關(guān)，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較后得出具體值。

（3）DON快檢測試儀檢測原理?；谀z體金免疫層析技術(shù)，以膠體金作為示蹤標(biāo)志物，根據(jù)膠體金本身的顯色特點來診斷特異性的待測物。

2 結(jié)果與分析

2.1 回收率與精密度、質(zhì)控樣精準(zhǔn)度試驗

在空白小麥樣品中分別加入3組不同濃度的DON標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照正常試驗步驟進(jìn)行前處理和檢測，每個加標(biāo)樣品重復(fù)測定6次，測定其回收率和精密度，結(jié)果見表1。由表1可知，3種設(shè)備檢測方法的回收率和精密度均達(dá)標(biāo)[3]。在低濃度檢測時高效液相色譜儀回收率略顯偏低，可能由于其方法前處理相對復(fù)雜，造成一定的DON損失。精密度方面，高效液相色譜儀精密度最高，穩(wěn)定性最好。

將兩個不同濃度DON質(zhì)控樣，按照正常試驗步驟進(jìn)行前處理和檢測，每個濃度做4個平行樣，測定其準(zhǔn)確度，結(jié)果見表2。從表2中可知高效液相色譜儀準(zhǔn)確度最高，其次是酶標(biāo)儀，快檢儀準(zhǔn)確度略顯不足，尤其是高濃度檢測時更明顯。由于快檢儀檢測原理和膠體金紙試劑條制備工藝等原因，快檢儀不適合做定量檢測。另外經(jīng)過多次試驗得出，酶標(biāo)儀在高通量樣品檢測時，由于抗體的交叉反應(yīng)、稀釋倍數(shù)及操作污染等因素影響，有出假陽性風(fēng)險，故陽性試樣需進(jìn)一步驗證[4]。

2.2 3種設(shè)備的操作使用對比

對3種設(shè)備在單位樣品檢驗時間、費用、操作等方面進(jìn)行綜合比較，結(jié)果見表3。從表3中可知，3種檢測設(shè)備各有優(yōu)劣，檢測機構(gòu)、企業(yè)或者檢驗人員可根據(jù)自身不同需求和環(huán)境、樣品量等因素綜合考量來選擇最合適的設(shè)備進(jìn)行檢驗。尤其是快檢儀操作簡便、靈敏度高，適合于樣品的快速篩查，可滿足我國糧食及飼料企業(yè)、政府職能監(jiān)管部門等開展日?，F(xiàn)場檢驗和監(jiān)管抽查工作[5]。

3 結(jié)論

本文主要對高效液相色譜儀、酶標(biāo)儀、真菌毒素快速檢測儀檢測小麥中嘔吐毒素的操作過程和檢測結(jié)果進(jìn)行對比分析。

從操作過程看，高效液相色譜儀前處理最為復(fù)雜和關(guān)鍵，直接影響結(jié)果準(zhǔn)確度，另外消耗試劑較多，易造成污染，主要操作為電腦軟件，能自動連續(xù)處理樣品，可用于科研和高質(zhì)量檢驗，對人員能力有一定要求;酶標(biāo)儀操作過程相對簡單，所需耗材成本也較低，但因其配置試劑較多，操作暴露風(fēng)險較大，有一定安全隱患，但能同時上機檢測96個樣品，單批次平均成本低，也可用于現(xiàn)場實驗，人員操作易上手;快檢儀操作最為簡單，所用耗材也較少，檢測過程比較安全，檢測速度較快，人員水平要求較低。

從檢測結(jié)果來看，3種設(shè)備回收率和精密度均符合要求，其中高效液相色譜儀精密度和準(zhǔn)確度最高;酶標(biāo)儀檢測可能會出現(xiàn)假陽性，因此在其檢測出陽性樣品時，可用高效液相色譜儀進(jìn)行復(fù)檢確認(rèn);快速檢測儀檢測速度較快，但其定量檢測準(zhǔn)確度不高，比較適用于快速定性檢測。

在實際應(yīng)用中，3種設(shè)備可以相互配合使用，靈活運用各種設(shè)備優(yōu)勢來高效率完成工作。糧食企業(yè)單位在新糧收購、轉(zhuǎn)運時可運用快速檢測儀進(jìn)行糧食DON指標(biāo)快速篩查，檢測機構(gòu)在集中進(jìn)行糧食品質(zhì)分析時，可運用酶標(biāo)儀進(jìn)行高通量檢測[6]，對以上兩個設(shè)備篩檢出的陽性批次可用高效液相色譜儀進(jìn)行精準(zhǔn)復(fù)核，提升檢測效率。日常檢驗工作中，快檢儀和酶標(biāo)儀可為高效液相色譜儀提供輔助性檢測，相互補充，取長補短，為精準(zhǔn)高效檢驗嘔吐毒素共同提供數(shù)據(jù)參考。

參考文獻(xiàn)

[1]張春娥，劉新保，廖若宇，等.高效液相色譜法測定全麥粉中的嘔吐毒素含量[J].糧油食品科技，2018，26（5）：53-57.

[2]國家衛(wèi)生和計劃生育委員會，國家食品藥品監(jiān)督管理總局.食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇及其乙?；苌锏臏y定：GB 5009.111—2016[S].北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2016.

[3]國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局，中國國家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會.實驗室質(zhì)量控制規(guī)范 食品理化檢測：GB/T 27404—2008[S].北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2008.

[4]賈衛(wèi)昌，朱寅.高效液相色譜法與酶聯(lián)免疫法檢測小麥中嘔吐毒素的比較研究[J].糧食與食品工業(yè)，2015，22（3）：97-100.

[5]李萌，馮才偉，賈芳芳，等.一種快速檢測嘔吐毒素的膠體金試紙條[J].中國釀造，2013，32（11）：91-93.

[6]莊蕓蕾.膠體金免疫快速檢測卡與酶聯(lián)免疫法檢測小麥中嘔吐毒素的技術(shù)比較[J].糧食儲藏，2017，46（3）：38-41.