歐貝麗++倪偉華++鄒+燕++趙佳麗

摘要 [目的]應(yīng)用超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)建立同時(shí)測定豬肉中15種β-受體激動(dòng)劑的檢測方法。[方法]樣品經(jīng)β-鹽酸葡萄糖醛苷酶/芳基硫酸酯酶酶解、0.2mol/L乙酸銨溶液（乙酸調(diào)pH至5.0）提取，陽離子固相萃取柱凈化，以0.01mol/L乙酸銨（含0.1%甲酸）-甲醇為流動(dòng)相梯度洗脫，C18柱為色譜柱進(jìn)行分離，串聯(lián)質(zhì)譜多反應(yīng)檢測（MRM）模式測定。[結(jié)果]15種β-受體激動(dòng)劑在5～100 ng/mL 濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，3種添加水平下樣品平均回收率在74.2%～115.6%之間。[結(jié)論]該方法提取效率高，凈化效果好，具有良好的靈敏度和準(zhǔn)確性，適合大批量豬肉樣品中15種β-受體激動(dòng)劑的快速測定。

關(guān)鍵詞 超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜；豬肉；β-受體激動(dòng)劑；固相萃取

中圖分類號 TS251.5+1 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A 文章編號 1007-5739（2015）12-0276-03

Determination of 15 β-agonists Residues in Pork by Ultra-performance Liquid Chromatography-mass Spectrometry

OU Bei-li NI Wei-hua ZOU Yan ZHAO Jia-li

（Jiaxing Institute for Food and Drug Control in Zhejiang Province，Jiaxing Zhejiang 314000）

Abstract [Objective]To develop a method for determination of 15β-agonists residues in pork by ultra-performance liquid chromatography-mass spectrometry.[Method]The samples were enzyme hydrolyzed by β-Glucuronidase/aryl sulfatase，etracted with 0.2 mol/L Acetic acid-ammonium acetate buffering solution（pH=5.0），and cleaned up on a SPE cartridge，separated on a C18 column using 0.01mol/L ammonium acetate（contain 0.1% Formic Acid）- Methanol as mobile phase，and detected under multiple reaction monitoring（MRM）mode.[Results]The resultes displayed a good linearity for 15β-agonists over the range of 5～100 ng/mL.The mean recoveries were from 74.2% to 115.6% at three different concentrations.[Conclusion]The method was precise，sensitive，and highly efficient in extraction and purification，and it is suitable for fast analysis of β-agonists residues in a large number of pork samples.

Key words ultra-performance liquid chromatography-mass spectrometry；pork；β-agonists；solid phase extraction

β-受體激動(dòng)劑，俗稱“瘦肉精”，是一類化學(xué)合成的結(jié)構(gòu)和功能類似于腎上腺素和去甲腎上腺素的苯乙醇胺類衍生物，用于治療支氣管哮喘、平滑肌痙攣等疾病[1]。人們在研究過程中發(fā)現(xiàn)，其具有促進(jìn)肌肉組織生長、減少脂肪沉積的作用，一些養(yǎng)殖戶為追求更大經(jīng)濟(jì)效益在飼料中添加β-受體激動(dòng)劑，以改善豬肉品質(zhì)。但是由于這類藥物在飼料中的添加劑量較大，易在肉中殘留，人一次攝入一定量的高殘留的豬肉即可出現(xiàn)β-受體激動(dòng)劑的毒副作用[2]，近年來食用β-受體激動(dòng)劑殘留超標(biāo)的肉類導(dǎo)致的中毒事件時(shí)有發(fā)生[3]。因此，該類食品安全問題已越來越受政府部門的重視，針對β-受體激動(dòng)劑殘留的初篩和確證方法研究已成為近年來獸藥殘留研究的熱點(diǎn)[4-5]。本研究考察了15種常見的β-受體激動(dòng)劑的提取凈化條件，最終建立了同時(shí)測定豬肉中15種β-受體激動(dòng)劑的UPLC-MS/MS方法。該方法快速準(zhǔn)確，適合大批量豬肉樣品中15種β-受體激動(dòng)劑的快速測定。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 儀器。美國Waters公司 Acquity UPLC型超高效液相色譜、Quattro Premiere XE型三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜、電噴霧離子化源（ESI）、MassLynx4.0數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)、單道可調(diào)移液器（10～100 μL、100～1 000 μL、1 000～5 000 μL德國Eppendorf公司）、Milli-Q Academic純水系統(tǒng)（美國Millipore公司）、BP211D電子天平（德國Sartorius）KQ-500E型超聲提取儀（上海儀器有限公司）、F6/10超細(xì)勻漿器（上海弗魯克科技發(fā)展有限公司）、Mediwax固相萃取真空多聯(lián)器（美國艾杰爾科技有限公司）、多功能氮吹儀（北京同泰聯(lián)科技發(fā)展有限公司）、3-18K高速冷凍離心機(jī)（德國SIGMA公司）。

1.1.2 藥品與試劑。鹽酸克倫特羅、鹽酸妥洛特羅、硫酸沙丁胺醇、硫酸特布他林對照品均購自中國藥品生物制品檢定所，β-鹽酸葡萄糖醛酸苷酶/芳基硫酸酯酶購于美國sigma公司，溴代克倫特羅、馬布特羅、溴布特羅、西布特羅、氯丙那林、馬賁特羅、苯氧丙酚胺購于德國WITEGA Laboratorien Berlin，奧西那林、非諾特羅、克萊多巴胺、福莫特羅購于Dr.Ehrenstorfer（Augsburg，德國）。流動(dòng)相所用甲醇、乙腈均為色譜純（德國，Merck公司），甲酸（純度為96%，TEDIA），乙酸銨（色譜純，TEDIA），試驗(yàn)用水均為Millipore超純水器制備超純水。endprint

1.1.3 樣品?？瞻棕i肉為經(jīng)檢驗(yàn)不含β-受體激動(dòng)的肉，10批豬肉樣品，5批購自嘉興市各大超市，5批購自嘉興市農(nóng)貿(mào)市場。將新鮮的空白豬肉和10批市售豬肉樣品絞碎并均質(zhì)，于-18 ℃冰箱避光保存，臨用前于4 ℃冰箱解凍。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 空白基質(zhì)溶液的配制。稱取均質(zhì)后的空白豬肉5.0 g于50 mL離心管中，加入約15 mL的0.2 mol/L乙酸銨-乙酸溶液（pH=5.0），渦旋混勻，超聲提取10 min，4 ℃條件下8 000 r/min離心5 min，上清液轉(zhuǎn)移至分液漏斗中，在提取液中加入正己烷，渦旋2 min，棄去正己烷層，保留提取液，作為空白基質(zhì)提取液。

1.2.2 混合對照品溶液的制備。精確稱取鹽酸克倫特羅、鹽酸妥洛特羅、硫酸沙丁胺醇、硫酸特布他林、溴代克倫特羅、馬布特羅、溴布特羅、西布特羅、氯丙那林、馬賁特羅、苯氧丙酚胺、奧西那林、非諾特羅、克萊多巴胺、福莫特羅對照品各10.00 mg，于10 mL棕色容量瓶中，用甲醇溶解并定容，制成1 mg/mL對照品儲備溶液。分別吸取適量的各β-受體激動(dòng)劑類藥物的對照品儲備液于刻度容量瓶中，用空白基質(zhì)提取液稀釋并定容，配成質(zhì)量濃度分別為5、10、20、40、80、100 ng/mL的混合對照品溶液，用于制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.3 樣品前處理。稱取均質(zhì)試樣5.0 g于50 mL離心管中，加入約15 mL的0.2 mol/L乙酸銨-乙酸溶液（pH=5.0），再加入12 000 U的β-鹽酸葡萄糖醛苷酶/芳基硫酸酯酶，渦旋混合10 min，于37 ℃水浴避光酶解6 h，每隔1 h，漩渦混勻1次。酶解完后于4 ℃條件下8 000 r/min離心5 min，上清液轉(zhuǎn)移至雞心瓶內(nèi)，在提取液中加入正己烷，渦旋2 min，棄去正己烷層，殘?jiān)?0 mL的0.2 mol/L乙酸銨-乙酸溶液（pH=5.0）重復(fù)提取1次，再次加入正己烷脫脂，合并提取液，在37 ℃水浴中減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至約2 mL，轉(zhuǎn)移至一干凈試管，用少量的0.2 mol/L乙酸銨-乙酸溶液（pH=5.0）洗滌雞心瓶2次，合并洗滌液于同一試管，待凈化濃縮。

Waters Oasis MCX柱依次用5 mL甲醇、5 mL水、2 mL 2%甲酸活化平衡，將上述提取液以0.25 mL/min的速度通過固相萃取柱，經(jīng)3 mL的0.2 mol/L乙酸銨-乙酸溶液（pH=5.0）、3 mL的甲醇淋洗，棄去淋洗液，再用3 mL 5%氨水甲醇洗脫，重復(fù)洗脫1次，將洗脫液用氮吹儀于45 ℃濃縮至近干，用1.00 mL初始流動(dòng)相溶解殘?jiān)?jīng)0.22 μm微孔濾膜濾過，供UPLC-MS/MS分析。

1.2.4 UPLC條件。色譜柱為Waters ACQUITY UPLC BEH C18 column（2.1×100 mm，1.7 μm），流動(dòng)相系統(tǒng)：A為甲醇溶液，B為10 mmol/L乙酸銨（0.1%甲酸）水溶液，梯度洗脫（0～1 min，維持15%A；1～3 min，15%A線性變化至20%A；3～4 min，20%A線性變化至40%A；4～7 min，維持40%A；7～8 min，40% A線性變化至60%A；8～9 min，60%A線性變化至100%A；9～10 min，100%A線性變化至15%A）。流速為0.2 mL/min，柱溫為40 ℃，進(jìn)樣量為5 μL。15種化合物的色譜分離情況見各MRM通道的疊加總離子流圖（圖1）。

1.2.5 質(zhì)譜條件。離子源：ESI+；毛細(xì)管電壓（kV）：3.00；離子源溫度：120 ℃；RF透鏡電壓：0V；脫溶劑溫度：350 ℃；脫溶劑氣體流量：650 L/Hr；錐孔反吹氣流量：50 L/Hr；質(zhì)量分析器：低端分辨率1（V）：13.0 V；高端分辨率1（V）：13.0 V；離子能量1（eV）：1.0；低端分辨率2（V）：13.0 V；高端分辨率2（V）：13.0 V；離子能量2（eV）：1.0。各種藥物的質(zhì)譜采集參數(shù)見表1。

2 結(jié)果與分析

2.1 前處理?xiàng)l件的優(yōu)化

β-受體激動(dòng)劑在動(dòng)物體內(nèi)吸收后，經(jīng)過代謝后大多數(shù)會與硫酸酯蛋白和葡萄糖醛酸作用，以硫酸軛何物和葡萄糖醛酸軛合物等結(jié)合態(tài)形式存在，因此需要將其轉(zhuǎn)化為游離態(tài)進(jìn)行檢測。β- 受體激動(dòng)劑類藥物具有含氮堿性中心，在弱酸環(huán)境中能離子化，雖然β-鹽酸葡萄糖醛苷酶宜在pH 值7左右的環(huán)境中酶解，但是為了保證β-受體激動(dòng)劑被提取出來游離在提取液中，因此選擇弱酸性的0.2 mol/L乙酸銨-乙酸溶液（pH=5.0）作為提取液。

2.2 色譜條件的優(yōu)化

根據(jù)文獻(xiàn)[6]，大多β-受體激動(dòng)劑類的色譜分離采用由0.1%甲酸溶液和甲醇或乙腈組成的混合溶液作為流動(dòng)相，試驗(yàn)比較了0.1%甲酸乙腈體系與0.1%甲酸-甲醇體系作為流動(dòng)相時(shí)的情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)0.1%甲酸乙腈體系作為流動(dòng)相時(shí)，沙丁胺醇、西布特羅、特布他林和奧西那林各通道之間有干擾（圖2），這些化合物在色譜柱上的保留不理想，化合物之間有相互轉(zhuǎn)化現(xiàn)象；在同樣梯度及色譜柱條件下，在流動(dòng)相水相中加入少量乙酸銨（10 mmol/L），待測物得到有效分離，各通道之間無干擾，保證測定靈敏度的同時(shí)，化合物之間的分離度也得到進(jìn)一步改善。

同時(shí)比較了Waters ACQUITY UPLC BEH C18 column（2.1×100 mm，1.7 μm）和 Waters ACQUITY UPLC CSH C18 Column（2.1×100mm，1.7 μm）2種色譜柱對該類化合物的分離效果。結(jié)果表明，雖然BEH柱上的個(gè)別化合物的響應(yīng)不如CSH柱上的響應(yīng)高，但對15種化合物整體分離效果BEH更好些，因此選用BEH C18柱。

2.3 方法學(xué)考察

考察了標(biāo)準(zhǔn)曲線及相關(guān)系數(shù)、精密度、回收率和定量限。“1.2.2”項(xiàng)下配制的各濃度的混合對照品溶液，按“1.2.4”和“1.2.5”項(xiàng)條件進(jìn)行分析，測得15個(gè)β-受體激動(dòng)劑的峰面積，依據(jù)峰面積與濃度的關(guān)系繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計(jì)算獲得線性關(guān)系（表2）?？梢钥闯?，9種β-受體激動(dòng)劑在5～100 ng/mL的 濃度范圍內(nèi)均有良好的線性關(guān)系。用空白基質(zhì)配制濃度均為50 ng/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，考察日內(nèi)精密度和日間精密度，日內(nèi)精密度由7次重復(fù)測定得到，日間精密度由連續(xù)5 d重復(fù)取樣測定得到，結(jié)果樣品的日內(nèi)精密度RSD均小于10%，日間精密度RSD均小于15%，均在可接受范圍內(nèi)。在空白樣品中分別加入10、40、80 ng/mL混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，渦旋混勻后，按“1.2.3”方法進(jìn)行提取凈化，按“1.2.4”“1.2.5”條件測定回收率，結(jié)果見表2。采用標(biāo)準(zhǔn)溶液，空白基質(zhì)提取液稀釋的方法，以S/N≥3時(shí)目標(biāo)物的含量為該方法的檢出限，以S/N≥10時(shí)目標(biāo)物的含量為該方法的定量限。經(jīng)計(jì)算本方法測定15種β-受體激動(dòng)劑的檢出限為0.01～0.12 μg/kg，定量限為0.05～0.38 μg/kg。endprint

2.4 樣品本底干擾的消除

由于豬肉基質(zhì)復(fù)雜，對離子化有很強(qiáng)的促進(jìn)或者抑制作用，為了消除樣品基質(zhì)效應(yīng)，以空白樣品提取液作為標(biāo)準(zhǔn)溶液的稀釋溶液，可以使標(biāo)準(zhǔn)品和樣品溶液具有同樣的離子化本底，從而消除了樣品的基質(zhì)效應(yīng)，使得該方法更加準(zhǔn)確。

3 結(jié)論

10份樣品中5份檢出不同濃度的克倫特羅，1份檢出沙丁胺醇。其中，檢出克倫特羅的5份樣品有4份來自農(nóng)貿(mào)市場，檢出沙丁胺春的樣品也購自農(nóng)貿(mào)市場。農(nóng)貿(mào)市場個(gè)體戶處購買的樣品，無論檢出概率和檢出量均大于大型超市購買的蓋有檢驗(yàn)檢疫印章的樣品。

本方法建立了同時(shí)測定豬肉中15種β-受體激動(dòng)劑殘留的超高效液相質(zhì)譜聯(lián)用檢測方法。前處理過程中應(yīng)用酶解方法進(jìn)行提取，再經(jīng)過混合陽離子交換柱進(jìn)行凈化。該方法提取效率高，凈化效果好，具有良好的靈敏度和準(zhǔn)確性，適合大批量豬肉樣品中15種β-受體激動(dòng)劑的快速測定。

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