羅云超 王琳

(西北農(nóng)林科技大學(xué) 陜西咸陽(yáng) 712100)

生物學(xué)領(lǐng)域已經(jīng)逐漸進(jìn)入后基因組的時(shí)代,其目的是通過(guò)對(duì)新基因的功能進(jìn)行高通量篩選并分析,從而闡明某些基因在人體的生長(zhǎng)發(fā)育以及疾病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的重要功能[1]。基因組編輯方法能對(duì)基因組遺傳物質(zhì)進(jìn)行準(zhǔn)確的定位,并進(jìn)行穩(wěn)定改造,從而為生物學(xué)領(lǐng)域的疑難問(wèn)題提供有效的解決方案[2]。

1 CRISPR/CAS系統(tǒng)誘導(dǎo)

使用Cas9系統(tǒng),在人293T細(xì)胞的打靶載體構(gòu)建基礎(chǔ)上,對(duì)相關(guān)基因?qū)嵭卸c(diǎn)的敲除,檢測(cè)打靶效率。

2 檢測(cè)方法

2.1 Surveyor檢測(cè)

(1)培養(yǎng)轉(zhuǎn)染過(guò)細(xì)胞,篩選陽(yáng)性克隆,擴(kuò)大培養(yǎng)以對(duì)細(xì)胞DNA進(jìn)行提取。

(2)通過(guò)設(shè)計(jì)好的引物擴(kuò)增目的基因,并擴(kuò)增未突變的野生型細(xì)胞基因。

(3)測(cè)定PCR產(chǎn)物濃度,并濃縮至終濃度約為20ng/ml,且使兩份樣品等量。

(4)均勻混合150ng wt與150ng待測(cè)樣品,放置PCR儀中雜交退火。

(5)在混合樣品中加入1ml的Enhancer S、lml的Nuclease S和0.15M MgCl2。

(6)將上述混合液置于42℃放置3h后,加入lml的Stop Solution中止反應(yīng)。

(7)計(jì)算突變效率。

2.2 AFLP檢測(cè)

(1)培養(yǎng)轉(zhuǎn)染過(guò)細(xì)胞,篩選陽(yáng)性克隆擴(kuò)大培養(yǎng)以對(duì)細(xì)胞DNA進(jìn)行提取。

(2)通過(guò)設(shè)計(jì)好引物擴(kuò)增目的基因,得到目的片段,純化回收膠,并進(jìn)行濃度測(cè)定。

(3)用限制性內(nèi)切酶PvuII酶切回收后的PCR片段。

(4)37℃,2h后中止反應(yīng),檢測(cè)瓊脂糖。

(5)計(jì)算突變效率。

2.3 HRM檢測(cè)

(1)在目的片段靶位點(diǎn)兩端,通過(guò)Beacon Designer軟件設(shè)計(jì)一段200bp左右的引物。

(2)培養(yǎng)轉(zhuǎn)染過(guò)的細(xì)胞,篩選陽(yáng)性克隆擴(kuò)大培養(yǎng)以對(duì)細(xì)胞DNA進(jìn)行提取。

(3)通過(guò)Light Cycler 480II定量PCR系統(tǒng),定量PCR擴(kuò)增。

(4)按比例加入Roche Dye染料,配制PCR體系,定量PCR擴(kuò)增。

(5)計(jì)算突變效率。

3 數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)學(xué)處理分析

采用SPSS18.0軟件處理研究結(jié)果,采用c2檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,P＜0.05時(shí)說(shuō)明兩者間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

4 結(jié)果與分析

CRISPR/CAS系統(tǒng)誘導(dǎo)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞基因組突變率為40%。另外,在三種檢測(cè)方法中,Surveyor檢測(cè)IL2RG基因的平均打靶效率為(20.5±1.5)%,AFLP檢測(cè)為(10.2±2.4)%,而HRM檢測(cè)為(41.4±5.4)%。HRM檢測(cè)最佳,Surveyor檢測(cè)次之,而AFLP檢測(cè)最差,兩兩間差異性具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

5 討論

基因組編輯不僅定位準(zhǔn)確,同時(shí)也能夠使染色體遺傳物質(zhì)進(jìn)行穩(wěn)定的改造[3]。該技術(shù)方法對(duì)于生物遺傳物質(zhì)的修改是一種較為理想的方式,不論是在基礎(chǔ)研究領(lǐng)域還是在實(shí)際應(yīng)用研究領(lǐng)域均具有廣闊的應(yīng)用廣闊的應(yīng)用前景和價(jià)值。基因編輯技術(shù)能夠使人們按照自己的設(shè)想對(duì)遺傳物質(zhì)進(jìn)行改造,有利于穩(wěn)定遺傳模型的建立,同時(shí)也為疑難雜癥等問(wèn)題提供了更加有效的解決辦法。通過(guò)使用基因編輯技術(shù),人類創(chuàng)造除了更加完美的品種,利用該技術(shù)使人們對(duì)相關(guān)疾病發(fā)生的分子機(jī)制有了更準(zhǔn)確的認(rèn)識(shí),有利于難治性疾病的治療提供了有力的科學(xué)理論依據(jù),技術(shù)促使人們探索生命科學(xué)本質(zhì)的可能性[4]。

通過(guò)本文研究結(jié)果,CRISPR/CAS系統(tǒng)打靶效果顯著,操作簡(jiǎn)單,具有較高識(shí)別效率。HRM檢測(cè)效率很高,是一種良好突變檢測(cè)方法。

[1]Cong L,Ran FA, Cox D,Lin SL,Barretto R,Habib N,Hsu PD,Wu XB,Jiang WY,Marraffini LA,Zhang F.Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems.Science,2013,339(6121):819-823.

[2]Wang HY,Yang H,Shivalila CS,Dawlaty MM,Cheng AW,Zhang F,Jaenisch R.One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering.Cell,2013,153(4):910-918.

[3]Garneau JE,Dupuis M ,Villion M,Romero DA,Barrangou R,Boyaval P,Fremaux C,Horvath P,Magadán AH,Moineau S.The CRISPR/Cas bacterial immune system cleaves bacteriophage and plasmid DNA. Nature,2011,468(7320):67-71.

[4]Feng ZY,Zhang BT,Ding WN,Liu XD,Yang DL,Wei PL,Cao FQ, Zhu SH,Zhang F,Mao YF,Zhu JK.Efficient genome editing in plants using a CRISPR/Cas system.Cell Res,2013,23(10):1229-1232.