邵碧英，董 建，陳 彬，陳文炳，黃曉蓉，鄭 晶，繆婷玉，彭 娟

（福建出入境檢驗(yàn)檢疫局 福建省檢驗(yàn)檢疫技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 福州　　350 001）

沙門(mén)氏菌核酸檢測(cè)試劑盒的評(píng)價(jià)

邵碧英，董 建，陳 彬，陳文炳，黃曉蓉，鄭 晶*，繆婷玉，彭 娟

（福建出入境檢驗(yàn)檢疫局 福建省檢驗(yàn)檢疫技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 福州350 001）

采用室內(nèi)技術(shù)參數(shù)驗(yàn)證和協(xié)同實(shí)驗(yàn)的方式對(duì)商品化沙門(mén)氏菌核酸檢測(cè)試劑盒在食品中沙門(mén)氏菌核酸檢測(cè)上的包容性、排他性、靈敏度、特異性、準(zhǔn)確度、檢測(cè)限、耐變 性、批間變異進(jìn)行評(píng)價(jià)。評(píng)價(jià)結(jié)果表明，試劑盒檢測(cè)結(jié)果與國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法檢測(cè)結(jié)果總體上無(wú)顯著差異，能滿足食品樣品的檢測(cè)要求；但對(duì)蔬菜制品的靈敏度較其他食品低，與國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法有顯著差異，因此該商品化試劑盒不適用于蔬菜制品中沙門(mén)氏菌核酸的檢測(cè)。

沙門(mén)氏菌；核酸檢測(cè)試劑盒；環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增；評(píng)價(jià)

沙門(mén)氏菌是最常見(jiàn)的食源性致病菌，傳統(tǒng)的檢驗(yàn)方法往往需要花費(fèi)很長(zhǎng)的時(shí)間。許多快速、靈敏的分子生物學(xué)方法已被應(yīng)用于食品微生物的快速檢驗(yàn)，克服了傳統(tǒng)檢驗(yàn)方法的缺陷，其中聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）已成為最普遍的食品微生物分子生物學(xué)檢驗(yàn)方法。近年來(lái)，在PCR技術(shù)基礎(chǔ)上又出現(xiàn)了新的技術(shù)，如環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）技術(shù)。LAMP技術(shù)具有簡(jiǎn)便、高效、特異、快速等優(yōu)點(diǎn)，在食品中過(guò)敏原［1-2］、轉(zhuǎn)基因成分［3-5］、致病菌［6-21］的篩選檢測(cè)上已得到較廣泛的應(yīng)用。市場(chǎng)上也出現(xiàn)了相關(guān)的商品化LAMP檢測(cè)試劑盒，如由廣州華峰生物科技有限公司生產(chǎn)的沙門(mén)氏菌核酸檢測(cè)試劑盒就是應(yīng)用LAMP法檢測(cè)食品中的沙門(mén)氏菌核酸。而這些商品化檢測(cè)試劑盒是否真正滿足日常檢測(cè)的需求，還需經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)室評(píng)價(jià)。本實(shí)驗(yàn)室已開(kāi)展了Easy TestTM菌落總數(shù)測(cè)試片［22］、3M PetrifilmTM金黃色葡萄球菌檢驗(yàn)測(cè)試片［23］的評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)，本實(shí)驗(yàn)在此基礎(chǔ)上，根據(jù)SN/T 2775—2011《商品化食品檢測(cè)試劑盒評(píng)價(jià)方法》［24］和SN/T 3256—2012《食品微生物檢驗(yàn)方法確認(rèn)技術(shù)規(guī)范》［25］的要求，以GB 4789.4—2010《食品微生物學(xué)檢驗(yàn)：沙門(mén)氏菌檢驗(yàn)》［26］為參考方法，研究建立了對(duì)廣州華峰生物科技有限公司生產(chǎn)的沙門(mén)氏菌核酸檢測(cè)試劑盒的評(píng)價(jià)方案，并進(jìn)行了評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)，以評(píng)估其在食品檢測(cè)中的準(zhǔn)確性和適用性，為更加準(zhǔn)確和規(guī)范地使用該商品化試劑盒、進(jìn)一步制定標(biāo)準(zhǔn)提供一定的參考依據(jù)。

1　　材料與方法

1.1材料與試劑

沙門(mén)氏菌標(biāo)準(zhǔn)菌株、參照菌株、實(shí)驗(yàn)室分離菌株、非沙門(mén)氏菌的標(biāo)準(zhǔn)菌株、供試食品樣品由本單位微生物實(shí)驗(yàn)室保存；沙門(mén)氏菌核酸檢測(cè)試劑盒［批號(hào)分別為Sal11121303、Sal12041702（R）、Sal11122202］由廣州華峰生物科技有限公司提供，除批間變異用3 個(gè)批號(hào)外，其他試驗(yàn)均用批號(hào)為Sal12041702（R）的試劑盒；GB 4789.4—2010所需培養(yǎng)基和試劑北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司。

1.2儀器與設(shè)備

Stomacher 3500型拍擊式均質(zhì)器英國(guó)Seward公司；BD115型恒溫培養(yǎng)箱德國(guó)Binder公司；MIKRO120型臺(tái)式高速離心機(jī)德國(guó)Hettich公司；2004型水浴鍋常州國(guó)華電器有限公司。

1.3方法

1.3.1菌懸液的制備

將沙門(mén)氏菌標(biāo)準(zhǔn)菌株、參照菌株、實(shí)驗(yàn)室分離菌株，非沙門(mén)氏菌的標(biāo)準(zhǔn)菌株分別活化后接種于營(yíng)養(yǎng)肉湯中，37 ℃培養(yǎng)18～24 h。

1.3.2包容性和排他性的測(cè)試

包容性是指確定某一檢測(cè)方法從眾多菌中檢測(cè)到目標(biāo)菌的能力，選擇100 株沙門(mén)氏菌的純化菌株，用核酸檢測(cè)試劑盒法進(jìn)行測(cè)試。排他性是指某一檢測(cè)方法對(duì)可能引起交叉反應(yīng)的相關(guān)非目標(biāo)菌株的抗干擾能力，選擇30 株非沙門(mén)氏菌的純化菌株，用核酸檢測(cè)試劑盒法進(jìn)行測(cè)試。核酸檢測(cè)試劑盒測(cè)試按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，呈橘色的即為陰性結(jié)果，呈綠色的即為陽(yáng)性結(jié)果。

1.3.3準(zhǔn)確度、特異性、靈敏度及檢測(cè)限的測(cè)試

參照文獻(xiàn)［25］，選擇家禽類、魚(yú)類和海產(chǎn)品、蔬菜制品、乳制品、雜品共5 類15 種代表性食品作為驗(yàn)證基質(zhì)。將腸炎沙門(mén)氏菌（ATCC13076）培養(yǎng)液適當(dāng)稀釋后，分別制備未接種（L0）、低濃度（L1）、高濃度（L2）3 個(gè)污染水平實(shí)驗(yàn)樣品，低濃度（L1）、高濃度（L2）兩個(gè)水平之間相差10 倍，分別用核酸檢測(cè)試劑盒和參考方法進(jìn)行測(cè)試，均進(jìn)行20 個(gè)平行。對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

相對(duì)準(zhǔn)確度：相同的樣品用核酸檢測(cè)試劑盒法和參考方法測(cè)試結(jié)果的一致程度，即LAMP方法和參考資料方法均確證為陽(yáng)性的數(shù)量與均確證為陰性的數(shù)量之和除以用于確證的樣品總數(shù)。

相對(duì)特異性：核酸檢測(cè)試劑盒法和參考方法均確證為陰性的總數(shù)除以參考方法確證為陰性的總數(shù)。

相對(duì)靈敏度：核酸檢測(cè)試劑盒法和參考方法均確證為陽(yáng)性的數(shù)量除以參考方法確證為陽(yáng)性的總數(shù)。

檢出限：當(dāng)檢出概率＞0.5時(shí)，25 g基質(zhì)中的菌含量即為方法的檢出限。檢出概率為檢出陽(yáng)性結(jié)果占所有檢測(cè)結(jié)果的比率，即：檢出概率=x/N，式中：x為檢出陽(yáng)性結(jié)果次數(shù)；N為測(cè)定總次數(shù)。

1.3.4耐變性的測(cè)試

分別取非目標(biāo)菌（肺炎克雷伯氏菌46117），高濃度、低濃度目標(biāo)菌（腸炎沙門(mén)氏菌ATCC13076）菌懸液，對(duì)核酸檢測(cè)試劑盒法的反應(yīng)溫度（正常設(shè)置為65 ℃）和反應(yīng)時(shí)間（正常設(shè)置為60 min）2 個(gè)變量進(jìn)行耐變性實(shí)驗(yàn)。每個(gè)變量取2 個(gè)不同的水平，反應(yīng)溫度取65 ℃和60 ℃，反應(yīng)時(shí)間取65 min和55 min。2 個(gè)變量進(jìn)行兩兩組合，每個(gè)組合進(jìn)行10 個(gè)平行。

1.3.5批間變異的測(cè)試

取純培養(yǎng)的1 株目標(biāo)菌（腸炎沙門(mén)氏菌ATCC13076）、1 株非目標(biāo)菌（肺炎克雷伯氏菌46117）的菌懸液，分別用3 個(gè)不同批號(hào)的沙門(mén)氏菌核酸檢測(cè)試劑盒進(jìn)行檢測(cè)，比較結(jié)果，以測(cè)試試劑盒的批間變異、穩(wěn)定性。

1.3.6室間協(xié)同實(shí)驗(yàn)

以牛乳為基質(zhì)，添加腸炎沙門(mén)氏菌培養(yǎng)液，制備成未接種（L0）、低濃度（L1）、高濃度（L2）3個(gè)接種水平的凍干樣品，發(fā)送8 家實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行協(xié)同實(shí)驗(yàn)。每一接種水平的樣品同時(shí)用核酸檢測(cè)試劑盒法和參考方法進(jìn)行測(cè)試，均做8 個(gè)平行，比較2 種方法的結(jié)果。

2　　結(jié)果與分析

2.1包容性和排他性的測(cè)試結(jié)果

選擇100 株經(jīng)確認(rèn)的沙門(mén)氏菌標(biāo)準(zhǔn)菌株（6 株）、參照菌株（5 株）和實(shí)驗(yàn)室分離菌株（89 株），用核酸檢測(cè)試劑盒進(jìn)行測(cè)試，結(jié)果全部為陽(yáng)性，表明該試劑盒在包容性上表現(xiàn)良好。

選擇30 株經(jīng)確認(rèn)的非沙門(mén)氏菌的標(biāo)準(zhǔn)菌株，用核酸檢測(cè)試劑盒進(jìn)行測(cè)試，結(jié)果全部為陰性，表明該試劑盒在排他性上表現(xiàn)良好。

2.2準(zhǔn)確度、特異性、靈敏度及檢測(cè)限的測(cè)試結(jié)果測(cè)試結(jié)果如表1所示，數(shù)據(jù)分析結(jié)果如表2所示。與參考方法相比，該核酸檢測(cè)試劑盒對(duì)家禽食品的相對(duì)準(zhǔn)確度、相對(duì)特異性、相對(duì)靈敏度均較好，試劑盒方法檢出限為1.12 CFU/g；對(duì)魚(yú)類和海產(chǎn)品的相對(duì)準(zhǔn)確度、相對(duì)特異性、相對(duì)靈敏度均較好，試劑盒方法檢出限為

表1　　15 個(gè)食品類型的實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 1　　Test results for 15 kinds of food samples

表2　相對(duì)準(zhǔn)確度、特異性、靈敏度及檢出限統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果TTaabbllee 22 　　SSttaattiissttiiccaall aannaallyyssiiss ooff rreellaattiivvee aaccccuurraaccyy， ssppeecciiffi i cciittyy，sensitivity and limit of detection

1.12 CFU/g；對(duì)蔬菜制品的相對(duì)靈敏度較差，試劑盒方法在1.12 CFU/g污染水平不能有效檢出；對(duì)乳制品的相對(duì)準(zhǔn)確度、相對(duì)特異性、相對(duì)靈敏度均較好，試劑盒方法檢出限為0.11 CFU/g；對(duì)雜品類食品的相對(duì)準(zhǔn)確度、相對(duì)特異性、相對(duì)靈敏度均較好，試劑盒方法檢出限為

1.12 CFU/g。

2.3耐變性的測(cè)試結(jié)果核酸檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)上所用的條件為：65 ℃、

表3　　耐變性測(cè)試結(jié)果Table 3　　Results of stability test

60 min，分別對(duì)反應(yīng)溫度和反應(yīng)時(shí)間2 個(gè)變量進(jìn)行耐變性實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如表3所示。檢測(cè)結(jié)果表明，該試劑盒在反應(yīng)溫度65 ℃、反應(yīng)時(shí)間55 min和反應(yīng)溫度60 ℃、反應(yīng)時(shí)間

65 min的實(shí)驗(yàn)條件下操作較為適宜。在65 ℃、65 min的條件下，反應(yīng)時(shí)間超過(guò)了說(shuō)明書(shū)規(guī)定的時(shí)間，就會(huì)出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果。在60 ℃、55 min的條件下，反應(yīng)溫度低于說(shuō)明書(shū)規(guī)定的適宜溫度，就會(huì)出現(xiàn)假陰性結(jié)果。因此超出試劑盒說(shuō)明書(shū)規(guī)定的反應(yīng)溫度或反應(yīng)時(shí)間，會(huì)出現(xiàn)假陽(yáng)性或假陰性結(jié)果。

2.4批間變異的測(cè)試結(jié)果

表 4　　批間變異測(cè)試結(jié)果Table 4　　Results of inter-batch variations

取3 個(gè)不同批號(hào)的試劑盒對(duì)目標(biāo)菌（腸炎沙門(mén)氏菌ATCC13076）和非目標(biāo)菌（肺炎克雷伯氏菌46117）進(jìn)行批間變異實(shí)驗(yàn)，測(cè)試結(jié)果如表4所示。結(jié)果表明，該試劑盒的批間總體差異較小，但個(gè)別出現(xiàn)假陽(yáng)性和假陰性的結(jié)果。

2.5協(xié)同實(shí)驗(yàn)的測(cè)試結(jié)果

8 家實(shí)驗(yàn)室對(duì)3 個(gè)接種水平樣品的測(cè)試結(jié)果如表5所示，統(tǒng)計(jì)結(jié)果如表6所示。結(jié)果分析表明2 種方法無(wú)顯著差異且方法穩(wěn)定可靠。

表5　　協(xié)同實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 5　　Results of collaboration test

表6　協(xié)同實(shí)驗(yàn)的統(tǒng)計(jì)結(jié)果TTaabbllee 66 　　SSttaattiissttiiccaall aannaallyyssiiss ooff ccoollllaabboorraattiioonn tteesstt

3　　結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)參考SN/T 2775—2011［24］和SN/T 3256—2012［25］

制訂的評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)方案對(duì)廣州華峰生物科技有限公司生產(chǎn)的沙門(mén)氏菌核酸檢測(cè)試劑盒開(kāi)展相關(guān)技術(shù)參數(shù)的驗(yàn)證，評(píng)價(jià)結(jié)果表明，試劑盒檢測(cè)結(jié)果與國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法［26］

檢測(cè)結(jié)果總體上比較無(wú)顯著差異，能滿足食品樣品的檢測(cè)要求；但蔬菜制品的靈敏度較其他食品低，與國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法有顯著差異，因此不適用于檢測(cè)蔬菜制品。沙門(mén)氏菌LAMP檢測(cè)方法具有快速、簡(jiǎn)便、靈敏的特點(diǎn)，無(wú)需使用大型儀器設(shè)備，適用于食品中沙門(mén)氏菌的快速篩查檢測(cè)，適合在基層實(shí)驗(yàn)室推廣應(yīng)用。

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［26］ 全國(guó)文獻(xiàn)工作標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)第七分委員會(huì). GB 4789.4—2010 食品微生物學(xué)檢驗(yàn): 沙門(mén)氏菌檢驗(yàn)［S］. 北京: 中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社， 2010.

Evaluation of Salmonella Nucleic Acid Detection Kit

SHAO Biying， DONG Jian， CHEN Bin， CHEN Wenbing， HUANG Xiaorong， ZHENG Jing*， MIAO Tingyu， PENG Juan
（Fujian Provincial Key Laboratory of Inspection and Quarantine Technology Research，F(xiàn)ujian Province Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau， Fuzhou35000 1， China）

The inclusiveness， exclusivity， sensitivity， specificity， accuracy， limit of detection （LOD）， resistance to denaturation and batch variation of the commercial Salmonella nucleic acid detection kit used to detect Salmonella in food samples were evaluated based on indoor technical parameters by validation and collaboration test. Results showed that the kit was not signifi cantly different from the national standard method in general， and could meet the requirements of food sample testing. However， the sensitivity for vegetables products was lower than those of other foods， which signifi cantly differed from the national standard method. Thus the commercial kit was not suitable for detection of Salmonella in vegetable products.

Salmonella； nucleic acid detection kit； loop-mediated isothermal amplifi cation； evaluation

Q93.33

A

1002-6630（2015）24-0242-04

10.7506/spkx1002-6630-201524045

2015-06-29

福建省科技計(jì)劃項(xiàng)目（2011Y0002）；國(guó)家認(rèn)監(jiān)委出入境檢驗(yàn)檢疫行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)制（修）訂計(jì)劃項(xiàng)目（2013B264K）作者簡(jiǎn)介：邵碧英（1973—），女，研究員，博士，研究方向?yàn)槭称飞飳W(xué)分子檢測(cè)。E-mail：byshao@sohu.com

鄭晶（1973—），女，研究員，碩士，研究方向?yàn)槭称肺⑸餀z驗(yàn)。E-mail：fjciqzj@qq.com