賈秀穩(wěn)，張立華，李先如，孟 健，艾征東，李欣宇

（棗莊學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，山東 棗莊　277160）

石榴花精油成分分析及清除自由基能力評價(jià)

賈秀穩(wěn)，張立華*，李先如，孟 健，艾征東，李欣宇

（棗莊學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，山東 棗莊277160）

采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)分析石榴花精油的化學(xué)成分，通過對2，2-聯(lián)氮基-雙-（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二氨鹽（2，2'-amino-di （2-ethyl -benzothiazoline sulphonic acid-6）ammonium salt，ABTS）及1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1 dipheny1-2 picryl-hydrazyl，DPPH）自由基的清除作用評價(jià)其抗氧化能力。結(jié)果表明，從石榴花精油中共分離出52 個(gè)質(zhì)譜峰，鑒定出32 種成分，其中有9 種烷烴類化合物（其中有5 種環(huán)烷烴和4 種直鏈烷烴）、7 種萜烯類化合物、6 種酯類化合物、4 種芳香族醇類化合物、酮類和醛類化合物各2 種、生物堿類和磺酸鹽類化合物各1 種。對ABTS+·和DPPH自由基清除力分別為0.029 mg/mg VC當(dāng)量和0.01 mg/mg VC當(dāng)量。表明石榴花精油中含有多種有應(yīng)用價(jià)值的化學(xué)成分，是一種具有開發(fā)利用價(jià)值的天然資源。

石榴花；精油；化學(xué)成分；抗氧化

植物精油是植物體內(nèi)產(chǎn)生的一種具有揮發(fā)性的次生代謝物，由分子質(zhì)量較小的簡單化合物組合而成，可隨水蒸氣蒸餾，是一類有氣味的揮發(fā)性油狀液體物質(zhì)，植物精油又稱為液體黃金［1］，商業(yè)上稱芳香油，化學(xué)和醫(yī)藥學(xué)上稱揮發(fā)油［2］。主要是從植物的根、莖、葉、花或果實(shí)等器官中獲得［3］，經(jīng)水蒸氣蒸餾法、壓榨法、吸收法、溶劑萃取法和超臨界二氧化碳萃取法等方法制得［4］。因其較高的生物活性可以廣泛應(yīng)用到醫(yī)藥、食品、化妝品等多個(gè)方面，所以對植物精油的開發(fā)利用一直備受關(guān)注，可謂一個(gè)經(jīng)久不息的研究熱點(diǎn)。石榴花是石榴科植物石榴（Punica granatum L.）的花，含有多酚類、黃酮類、三萜類等多種成分［5］，收載于衛(wèi)生部《藥品標(biāo)準(zhǔn)（維吾爾藥分冊）》中，具有止癢、止瀉、止血等多種功效，主要用于治療中耳炎和糖尿病等癥［6］?，F(xiàn)代研究［7］表明，石榴花具有降血脂、降血壓的作用。由于石榴花花期長，開花量大，大部分花不能正常結(jié)果而自然脫落，因此石榴花的資源豐富，極具開發(fā)價(jià)值［8］。然而對石榴活性物質(zhì)的研究和開發(fā)多集中于石榴葉、果皮和籽，對石榴花的研究才剛剛起步，相關(guān)報(bào)道較少，對石榴花精油的有關(guān)研究更是鮮有報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)采用水蒸餾法從石榴花中提取精油并用氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（gas chromatography-mass-mass spectrometer，GC-MS/MS）聯(lián)用儀分析研究石榴花精油的化學(xué)成分，利用2，2-聯(lián)氮基-雙-（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二氨鹽（2，2'-amino-di （2-ethyl -benzothiazoline sulphonic acid-6）ammonium salt，ABTS）和1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1 dipheny1-2 picryl-hydrazyl，DPPH）自由基清除法來評價(jià)石榴花精油的抗氧化活性，為石榴花資源的開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

石榴花樣品（品種為崗榴）于2014年6月采自棗莊學(xué)院校園，由棗莊學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院植物學(xué)教研室李思健副教授鑒定為石榴科石榴屬植物石榴（Punica granatum L.）的花，樣品于65 ℃恒溫烘干，放置于冰箱貯存?zhèn)溆谩?/p>

ABTS、DPPH美國Sigma公司；無水硫酸鈉、無水乙醚、甲醇等均為國產(chǎn)分析純，實(shí)驗(yàn)用水為去離子水。

1.2儀器與設(shè)備

7000B GC-MS聯(lián)用儀美國Agilent公司；UV2000紫外-可見分光光度計(jì)尤尼柯（上海）儀器有限公司。

1.3方法

1.3.1石榴花精油的提取

采用水蒸氣蒸餾法提取石榴花精油［9］，并略作調(diào)整。具體步驟：將石榴花用研缽研碎后稱量40.00 g置于1 000 mL圓底燒瓶中，加水400 mL，用揮發(fā)油蒸餾管蒸餾提取6 h。重復(fù)上述步驟提取10 次，合并10 次的提取產(chǎn)物，得到具有濃郁香味的淡黃色油狀物，取出一部分用乙醚溶解并加入少量無水硫酸鈉脫水處理，再用于GC-M/MS測試。

1.3.2GC-MS/MS分析

參照文獻(xiàn)［10］的方法并加以改進(jìn)，具體操作條件：高純氦氣為載氣，體積流量1.0 mL/min，分流比為20∶1；進(jìn)樣口溫度280 ℃；進(jìn)樣量0.5 μL，色譜柱初始溫度60 ℃，以5 ℃/min升至270 ℃，保持10 min。電子電離源；電子能量70 eV；質(zhì)量掃描范圍m/z 350～450；MS數(shù)據(jù)庫NIST 11。

1.3.3石榴花精油對ABTS+·的清除作用測定

采用文獻(xiàn)［11］的方法略做改進(jìn)。7 mmol/L溶液與2.45 mmol/L過硫酸鉀混合，置于暗處12～16 h，用甲醇將ABTS+·溶液稀釋至在波長732 nm吸光度0.70±0.02。將提取的石榴花精油樣品用甲醇配制成質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL的母液，按一定量與2 mL ABTS+·溶液混合，并用水補(bǔ)充反應(yīng)體系至3 mL，搖勻后靜置6 min后，在波長732 nm處測吸光度。每份樣品平行操作3 次。清除率按公式（1）計(jì)算。

式中：A0為2 mL ABTS+·溶液與1 mL甲醇混合后的吸光度；A樣為2 mL ABTS+·溶液與1 mL樣品混合后的吸光度。

繪制不同用量條件下清除率曲線，并求出清除率為50%時(shí)的用量，即半抑制濃度（the half maximal inhibitory concentration，IC50）。以質(zhì)量濃度0.02 mg/mL的VC為參照，按上述步驟操作并求出IC50，通過比較二者的IC50值計(jì)算出樣品相當(dāng)于VC用量，即VC當(dāng)量（mg/mg VC）。

1.3.4石榴花精油對DPPH自由基的清除作用測定

參照文獻(xiàn)［12］的方法并加以改進(jìn)，操作方法：向波長517 nm處吸光度為1.5的DPPH-甲醇溶液中加入一定量的試樣（空白對照用等量重蒸水代替），總體積用蒸餾水補(bǔ)充至3 mL用力搖勻后于室溫條件下放置30 min，再用光徑1 cm比色皿中測定DPPH混合溶液在波長517 nm處吸光度（A517 nm），用2.5 mL甲醇與0.5 mL試樣混合液調(diào)儀器零點(diǎn)，以扣除試樣本身顏色的影響。自由基清除率按公式（2）計(jì)算：

DPPH自由基清除率/%=（A′0－A′樣）/A′0×100 （2）

式中：A′0為2 mL DPPH溶液與1 mL甲醇混合后的吸光度；A′樣為2 mL DPPH溶液與1 mL樣品混合后的吸光度。

繪制不同用量條件下清除率曲線，并求出IC50。以質(zhì)量濃度0.02 mg/mL的VC為參照，按上述步驟操作并求出IC50，通過比較二者的IC50值計(jì)算出樣品的VC當(dāng)量（mg/mg VC）。

2　結(jié)果與分析

2.1石榴花精油的化學(xué)成分

圖 1 石榴花精油GC-MS/MS總離子流色譜圖Fig.1　GC-MS/MS total ion chromatogram of essential oil from pomegranate fl ower

如圖1所示，共分離出52 個(gè)質(zhì)譜峰，經(jīng)從NIST 11數(shù)據(jù)庫檢索，并結(jié)合參考相關(guān)質(zhì)譜文獻(xiàn)［13-14］，初步判斷出其中32 種化合物成分，鑒定結(jié)果如表1所示。其中以含C、H及O的化合物為主，也有少量的物質(zhì)含有N、S等其他原子。包括9 種烷烴類化合物（其中有5 種環(huán)烷烴和4 種直鏈烷烴）、7 種萜烯類化合物、6 種酯類化合物、4 種芳香族醇類化合物、2 種酮類化合物、2 種醛類化合物、1 種生物堿類化合物及1 種磺酸鹽類化合物。石榴花精油獨(dú)特的香味即由上述物質(zhì)呈現(xiàn)。其中生物活性比較高的成分有二十五烷、二十四烷、α-蓽澄茄油烯、欖香烯、石竹烯、愈創(chuàng)木烯、3-糖醛等［15］。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，石榴花精油中有C15H24（7 種）、C15H22（3 種）和C15H26O （3 種）3 類同分異構(gòu)體。C15H22的同分異構(gòu)體有2 種是倍半萜烯類化合物，一個(gè)是烷烴類；C15H26O的3 種同分異構(gòu)體則全是醇類化合物；C15H24的同分異構(gòu)體最多，共有7 種，且保留時(shí)間集中在17.048 0～21.310 8 min范圍內(nèi)，這7 種化合物有5 種是倍半萜烯類化合物，另外2 種是環(huán)烷烴類化合物。通過峰面積可以判斷倍半萜烯類化合物是石榴花精油香氣的主要成分。

表1　石榴花精油化學(xué)成分TTaabbllee 11 　CChheemmiiccaall ccoonnsstituents of essential oil from pomegranate fl ower

2.2石榴花精油對ABTS+·的清除作用

ABTS+·是一種呈藍(lán)綠色相對穩(wěn)定的水溶性自由基，抗氧化劑與ABTS+·反應(yīng)后使其溶液褪色，特征吸光度降低。在該反應(yīng)體系中，溶液褪色越明顯則表明所檢測物質(zhì)的總抗氧化能力越強(qiáng)［16］，在波長732 nm處測定其吸光度即可測定并計(jì)算出樣品的ABTS+·清除能力。如圖2所示，當(dāng)清除率為50%時(shí)，石榴花精油和VC的用量分別是348.8 μL和487.8 μL，石榴花精油相對于VC的當(dāng)量數(shù)為0.029 mg/mg。表明石榴花精油具有較弱的ABTS+·清除能力。

圖2　石榴花精油對ABBTTSS+·的清除作用Fig.2　ABTS+· free radical scavenging-capacity of essential oil of pomegranate fl ower

2.3石榴花精油對DPPH自由基的清除作用

DPPH是一種人工合成的有機(jī)自由基，其結(jié)構(gòu)中含有3 個(gè)苯環(huán)，1 個(gè)氮原子上有1 個(gè)孤對電子，常用來評估抗氧化物的供氫能力，它在有機(jī)溶劑中非常穩(wěn)定，呈紫色，在波長517 nm處有強(qiáng)吸收［17］。當(dāng)反應(yīng)體系中存在抗氧化劑時(shí)，抗氧化劑提供氫原子和電子給DPPH自由基，使其生成無色產(chǎn)物，導(dǎo)致溶液的特征吸收峰下降，吸光度變小。在此反應(yīng)中，體系顏色變得越淺表明所檢測物質(zhì)的抗氧化能力越強(qiáng)［18］。因此，可通過測定吸光度的變化來評價(jià)樣品對DPPH自由基的清除效果。如圖3所示，當(dāng)清除率為50%時(shí)，石榴花精油和VC的用量分別是480.6 μL和483.1 μL，石榴花精油相對于VC的當(dāng)量數(shù)為0.01 mg/mg。表明石榴花精油具有較弱的清除DPPH自由基能力。

圖3　 石榴花精油對DPPH自由基的清除作用Fig.3　DPPH free radical scavenging-capacity of essential oil of pomegranate fl ower

3　討 論

植物類精油按化學(xué)結(jié)構(gòu)可分為脂肪族、芳香族和萜類3 大類化合物以及它們的含氧衍生物如醇、醛、酮、酸、醚、酯、內(nèi)酯等，此外還有含氮和含硫的化合物［19-20］。本實(shí)驗(yàn)用GC-MS/MS法分析了石榴花精油的化學(xué)成分，并鑒定了其中32 種化合物成分，這些化合物以含C、H 和O元素為主，少數(shù)還含有N、S等雜原子的。含量較多的化合物為酯類、烷烴類和萜類。本實(shí)驗(yàn)鑒定的32 種化合物中，相對分子質(zhì)量最大的化合物是1，54二溴-五十四烷，相對分子質(zhì)量最小的化合物是3-糖醛。陳志偉等［10］的研究結(jié)果與本實(shí)驗(yàn)有些差別，從石榴花揮發(fā)油中分離鑒定出23 種化合物，主要成分為醛類和脂肪酸，且所有化合物中都不含氮、硫等其他雜原子。鑒定出的23 種化合物中，相對分子質(zhì)量最小化合物為3-甲基2-丁烯-1-醇、相對分子質(zhì)量最大化合物為二十五烷。分析其產(chǎn)生較大差別的原因，可能是本實(shí)驗(yàn)所用的GC-MS/MS二級質(zhì)譜測定增強(qiáng)了結(jié)構(gòu)解析和定性能力，提高了特異性離子靈敏度；也可能石榴花的產(chǎn)地和品種的不同導(dǎo)致石榴花精油化學(xué)成分有所差異。

在本實(shí)驗(yàn)所鑒定的主要成分中，欖香烯是一種易通過血腦屏障的國家二級抗腫瘤新藥［21］。在臨床廣泛用于惡性漿膜腔積液、肺癌、消化道腫瘤、腦瘤以及其他淺表性腫瘤的治療［22］。石竹烯可用于調(diào)配丁香、胡椒、肉豆蔻、柑橘、藥草等食用香精，也可用于合成其他香料［23］。因此，石榴花精油中化學(xué)成分不僅種類多，而且有些成分應(yīng)用價(jià)值較高。

石榴花精油對ABTS+·和DPPH自由基清除力分別為0.029 mg/mg VC和0.01 mg/mg VC當(dāng)量，即其對2 種清除力分別是VC的2.9%和1%。有研究［24-25］表明，植物精油的抗氧化活性主要依賴于其中酚類物質(zhì)的含量，含量越高抗氧化活性越強(qiáng)，相反，抗氧化活性就弱。本實(shí)驗(yàn)檢測出石榴花精油的成分主要是烷烴類、萜烯類、酯類、芳香族醇類、酮類、醛類、生物堿類和磺酸鹽類 化合物。這些物質(zhì)遇到ABTS+·、DPPH自由基時(shí)，不容易提供氫而發(fā)生反應(yīng)，所以表現(xiàn)比較弱的自由基清除力。而本實(shí)驗(yàn)在石榴花精油中未檢出酚類物質(zhì)，這可能就是石榴花精油抗氧化活性弱的原因。陳志偉等［10］雖然在石榴花揮發(fā)油中檢測出酚類物質(zhì)，但其含量僅為1.36%。

綜上所述，石榴花精油化學(xué)成分較豐富，且具有較高的應(yīng)用價(jià)值，可作為保健藥品資源。

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Analysis of the Chemical Constituents of Essential Oil from Pomegranate Flower and Evaluation of Its Free Radical Scavenging Ability

JIA Xiuwen， ZHANG Lihua*， LI Xianru， MENG Jian， AI Zhengdong， LI Xinyu
（College of Life Sciences， Zaozhuang University， Zaozhuang277160， China）

Abstracts: Gas chromatography-mass spectrometer （GC-MS） was used to analyze the chemical components in essential oil of pomegranate fl ower. The free radical scavenging ability of the oil was assessed by using 1，1 dipheny1-2 picryl-hydrazyl （DPPH） system and 2，2'-amino-di （2-ethyl -benzothiazoline sulphonic acid-6） ammonium salt （ABTS+·） system. The results showed that 52 peaks were detected from the pomegranate fl ower oil and 32 compounds were identifi ed， including 9 alkanes （5 naphthenic hydrocarbons and 4 straight-chain alkanes）， 7 terpenes， 6 esters， 4 alcohols， 2 ketones and aldehydes，1 alkaloid and sulfonate. The free radical scavenging capacity of the oil against ABTS+· and DPPH free radicals were 0.029 and 0.01 mg/mg vitamin C （VC） equivalent， respectively. These results indicate that pomegranate fl ower essential oil contains a variety of chemical constituents with potential applications as a valuable natural resource.

pomegranate fl ower； essential oil； chemical constituents； antioxidant activity

R962

A

1002-6630（2015）24-0152-04

10.7506/spkx1002-6630-201524027

2015-03-31

山東省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（ZR2013BL018）；棗莊學(xué)院大學(xué)生創(chuàng)新訓(xùn)練項(xiàng)目（2014018）

賈秀穩(wěn)（1991—），女，本科生，研究方向?yàn)樗幱弥参镔Y源開發(fā)。E-mail：2455818660@qq.com

張立華（1969—），男，教授，博士，研究方向?yàn)橹参镔Y源開發(fā)及采后生理。E-mail：chinazhanglh@163.com