楊天偉，張 霽，史云東，李 濤，王元忠，*，劉鴻高*（1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)與生物技術(shù)學(xué)院，云南 昆明　65001；.云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院藥用植物研究所，云南 昆明　65000；.玉溪師范學(xué)院資源環(huán)境學(xué)院，云南 玉溪　65100）

紅外光譜結(jié)合多元統(tǒng)計(jì)分析快速鑒別不同種類牛肝菌

楊天偉1，2，張 霽2，史云東3，李 濤3，王元忠2，*，劉鴻高1，*
（1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)與生物技術(shù)學(xué)院，云南 昆明650201；2.云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院藥用植物研究所，云南 昆明650200；3.玉溪師范學(xué)院資源環(huán)境學(xué)院，云南 玉溪653100）

采用傅里葉變換紅外光譜結(jié)合多元統(tǒng)計(jì)分析方法快速鑒別不同種類食用牛肝菌。采集10 個(gè)不同種類93 個(gè)牛 肝菌子實(shí)體的紅外光譜，分析食用牛肝菌的紅外光譜特征；用多元散射校正（multiplicative signal correction，MSC）、標(biāo)準(zhǔn)正態(tài)變量（standard normal variate，SNV）、二階導(dǎo)數(shù)（second derivative，SD）、Norris平滑（ND）、正交信號校正（orthogonal signal correction，OSC）、小波壓縮等方法對光譜進(jìn)行優(yōu)化處理；經(jīng)優(yōu)化處理的光譜數(shù)據(jù)分別建立馬氏距離分類模型及偏最小二乘判別分析（partial least squares discriminant analysis，PLSDA）。結(jié)果顯示，牛肝菌在3 325、2 934、2 927、1 637、1 547、1 402、1 375、1 259、1 453、1 081、1 029 cm－1等附近有多個(gè)吸收峰，主要?dú)w屬為蛋白質(zhì)、多糖、氨基酸等的特征吸收峰。MSC+SD+ND（15∶5）和SNV+SD+ ND（15∶5）兩種預(yù)處理方式前10 個(gè)主成分累積貢獻(xiàn)率分別為95.58%、95.54%，基于兩種預(yù)處理方法建立馬氏距離分類模型，驗(yàn)證集預(yù)測準(zhǔn)確率分別為90%和95%。PLS-DA結(jié)果顯示經(jīng)MSC+SD+ND（15∶5）和SNV+SD+ND （15∶5）預(yù)處理不易于區(qū)分牛肝菌種類；原始光譜經(jīng)正交信號校正及小波壓縮（orthogonal signal correction wavelet compression，OSCW）、優(yōu)化處理并進(jìn)行PLS-DA分析，能夠很好地區(qū)分不同種類牛肝菌。馬氏距離分類模型不僅能反映樣品的分類情況，同時(shí)計(jì)算出與測試樣品相似度最大的物種，可為食用菌種類鑒別和未知物種鑒定提供可靠依據(jù)；OSCW預(yù)處理后進(jìn)行 PLS-DA分析能有效鑒別不同種類牛肝菌，為野生食用菌的鑒別分類提供一種輔助方法。

紅外光譜；牛肝菌；鑒別；馬氏距離；偏最小二乘判別分析

食用菌營養(yǎng)豐富、食味獨(dú)特，是集營養(yǎng)、保健、藥用于一體的健康食品，大量研究表明食用菌富含蛋白質(zhì)、膳食纖維、多糖、氨基酸、維生素、礦質(zhì)元素等營養(yǎng)物質(zhì)［1-4］，可作為人體8 種必需氨基酸和易缺乏微量元素Ca、Fe、Mg、Mn、Zn、Se等的重要來源［3，5-6］；多糖類物質(zhì)具有抗氧化、防癌抗癌、防病治病、增強(qiáng)人體免疫力等功效［7-9］。我國食用菌種類多、產(chǎn)量大，是世界上最大的食用菌生產(chǎn)國和出口國［10］；云南多樣的立體氣候和豐富的森林資源孕育了大量的野生食用菌資源，牛肝菌、松茸、塊菌等珍稀食用菌深受消費(fèi)者親睞，已遠(yuǎn)銷歐洲、日本等國家，其中牛肝菌成為菌類產(chǎn)品中出口量大、換匯率高的暢銷產(chǎn)品。野生食用菌不與人爭糧，不與農(nóng)爭時(shí)、爭地的特征及人們?nèi)找嬖鲩L的消費(fèi)需求，市場價(jià)格不斷增漲，推動(dòng)了農(nóng)民采集野生食用菌的積極性，成為增收的重要來源之一。然而食用菌種類繁多，種間形態(tài)相似性高，不易準(zhǔn)確鑒別，因誤食引起的中毒事件時(shí)有發(fā)生；市場上出現(xiàn)以假充真、以次充好的現(xiàn)象，甚至有不法商販?zhǔn)召徲卸九８尉?，制成干片后混淆出售，?yán)重威脅消費(fèi)者健康、擾亂食用菌市場。

王向華［11］從云南市場上收購了6 種當(dāng)?shù)胤Q為“北風(fēng)菌”的真菌，研究發(fā)現(xiàn)這6 種野生菌中有一類為皂味口蘑（Tricholoma saponaceum （Fr .） Kummer），該菌為有毒真菌不宜食用；食用菌市場上同名異物的“北風(fēng)菌”僅為一例，其他形態(tài)相似極易混淆物種還大量存在。英國真菌學(xué)家Dentinger等［12］報(bào)道用超市購買的中國云南出口美味牛肝菌進(jìn)行DNA測序分析，發(fā)現(xiàn)同一包裝袋內(nèi)15 片牛肝菌中有3 種新牛肝菌物種，提出豐富多樣的牛肝菌種類也許對消費(fèi)者存在安全隱患。這些研究一方面表明真菌的物種多樣性及中國野生食用菌的豐富多樣性，另一方面提示人們準(zhǔn)確鑒別不同種類野生食用菌的重要性。

野生食用牛肝菌的準(zhǔn)確鑒別是保障消費(fèi)者安全，深入開發(fā)、研究和市場質(zhì)量控制的前提基礎(chǔ)。傳統(tǒng)野生食用菌鑒別主要憑借經(jīng)驗(yàn)，根據(jù)牛肝菌生長特性、外觀型貌、顯微結(jié)構(gòu)、菌肉菌管的顏色及變色反應(yīng)等進(jìn)行鑒別分類［13］，該方法受主觀因素干擾較大。目前對食用菌鑒別分類研究主要有光譜法和分子生物學(xué)方法，本課題組依據(jù)牛肝菌紫外光譜特征結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)方法研究了牛肝菌不同產(chǎn)地、種類和部位的鑒別方法［14-15］，周在進(jìn)［13］、時(shí)有明［16］等運(yùn)用傅里葉紅外光譜結(jié)合光譜檢索、聚類分析法鑒別了部分食用菌。Feng Bang等［17］通過分析牛肝菌3 個(gè)基因片段的DNA系列變異情況，揭示我國牛肝菌物種多樣性；Mello等［18］根據(jù)ITS片段設(shè)計(jì)引物，用分子生物學(xué)方法鑒別了銅色牛肝菌（Boletus aereus Bull.）和美味牛肝菌（Boletus edulis Bull.）；李艷春等［19］研究了市場上常見4 種牛肝菌的DNA條形碼，結(jié)果表明4 種牛肝菌樣品代表了12 個(gè)物種；Wu Gang等［20］分析了牛肝菌屬的DNA系列，并結(jié)合牛肝菌形態(tài)特征、顯微結(jié)構(gòu)等建立了牛肝菌科分子發(fā)育系統(tǒng)框架；分子生物學(xué)方法價(jià)格昂貴，操作復(fù)雜，不適宜推廣應(yīng)用。

傅里葉紅外光譜具有操作簡便、樣品量少、分析快速、樣品無損等優(yōu)點(diǎn)［21-22］，已廣泛應(yīng)用于中藥材產(chǎn)地、物種鑒別［23-24］，食品分析［25-26］，農(nóng)業(yè)［27］等領(lǐng)域。本研究通過采集10 種野生食用牛肝菌93 個(gè)子實(shí)體的紅外光譜信息，對原始光譜進(jìn)行平滑、求導(dǎo)、多元散射校正（multiplicative signal correction，MSC）、標(biāo)準(zhǔn)正態(tài)變量（standard normal variate，SNV）、正交信號校正（orthogonal signal correction，OSC）等優(yōu)化處理；經(jīng)優(yōu)化處理的光譜數(shù)據(jù)分別建立馬氏距離分類模型及進(jìn)行偏最小二乘判別分析（partial least squares discriminant analysis，PLS-DA），為快速鑒別牛肝菌種類提供輔助方法。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

表1　牛肝菌樣品信息Table 1　Information aboutt Bolleettuuss sampplleess

10 種牛肝菌均于2012年采自云南省玉溪市易門縣，由云南農(nóng)業(yè)大學(xué)劉鴻高教授鑒定，保存于云南農(nóng)業(yè)大學(xué)，詳細(xì)信息見表1。

1.2儀器與試劑

Frontier型傅里葉變換紅外光譜儀（采用DTGS檢測器，光譜分辨率為4 cm－1）美國Perkin Elmer公司；YP-2型壓片機(jī)上海市山岳科學(xué)儀器有限公司；FW-100型高速粉碎機(jī)天津市華鑫儀器廠；80 目標(biāo)準(zhǔn)篩盤浙江上虞市道墟五四儀器廠。

KBr（分析純）天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司。

1.3方法

1.3.1采集光譜信息

牛肝菌樣品采集后清洗干凈，50 ℃烘干至質(zhì)量恒定，粉碎，過80 目篩，備用。稱取牛肝菌樣品（1.5±0.2） mg、KBr（1002） mg，在紅外線燈下充分混合研磨，混合均勻的粉末放入模具將其壓成厚度均勻的透明薄片。設(shè)定光譜掃描范圍4 000～400 cm－1，累計(jì)掃描次數(shù)：16 次，每個(gè)樣品測定3 次，取平均光譜。樣品1#重復(fù)稱取7 份，分別壓片測定，考察重復(fù)性，取同一片樣品重復(fù)測定7 次，考察方法精密度，取同一片樣品分別在0、10、20、30、40、50、60 min時(shí)測定（每次測完立即放到紅外線燈下，以防吸水），考察穩(wěn)定性。實(shí)驗(yàn)過程中時(shí)時(shí)扣除背景干擾。

1.3.2光譜優(yōu)化處理和數(shù)據(jù)分析

光譜數(shù)據(jù)采集時(shí)受儀器噪音、樣品差異、環(huán)境等諸多因素影響；對原始光譜進(jìn)行優(yōu)化處理，可以降低或消除噪音、背景等的干擾，提高光譜分析的精度。常用的光譜預(yù)處理方法主要有平滑、求導(dǎo)、MSC、SNV、OSC等，這些方法各具優(yōu)點(diǎn)，如光譜平滑能減弱噪音干擾，光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行求導(dǎo)可以消除基線漂移和噪音干擾，MSC可減小散射光帶來的誤差，OSC能有效去除與目標(biāo)變量無關(guān)的干擾信息，提高光譜分析的準(zhǔn)確度［28-29］。優(yōu)化處理后的紅外光譜數(shù)據(jù)分別建立馬氏距離判別分類模型和進(jìn)行PLS-DA分析。

2　結(jié)果與分析

2.1實(shí)驗(yàn)方法學(xué)考察

運(yùn)用Omnic 8.2軟件的光譜檢索功能，建立重復(fù)性、精密度、穩(wěn)定性的光譜數(shù)據(jù)庫：A1、A2、A3，分別計(jì)算用于方法學(xué)考察樣品的匹配分值，匹配分值越大方法越可靠［13］。結(jié)果顯示重復(fù)性、精密度、穩(wěn)定性的匹配值分別在99.42%～99.93%、99.90%～99.99%、99.21%～99.97%之間，表明方法穩(wěn)定性好，精密度高。

2.2不同種類牛肝菌紅外光譜分析

圖 1　不同種類牛肝菌平均紅外光譜Fig.1　Mean FTIR spectra of different species of boletus

由圖1可看出，不同種類牛肝菌紅外光譜的峰形、峰位基本一致，而峰高（吸光度）等具有差異，表明不同種類牛肝菌的化學(xué)組分基本相同，而對化學(xué)成分的積累量不同。牛肝菌在3 325 cm－1附近的強(qiáng)吸收峰歸屬為蛋白質(zhì)、多糖、纖維素等的O—H伸縮振動(dòng)和蛋白質(zhì)中的N—H伸縮振動(dòng)；2 934、2 927 cm－1附近明顯的吸收峰主要為多糖、蛋白質(zhì)等甲基的對稱伸縮振動(dòng)；1 637 cm－1附近吸收峰歸屬為蛋白質(zhì)酰胺Ⅰ帶和C=O伸縮振動(dòng)；1 547 cm－1附近為蛋白質(zhì)C=N、N—H的伸縮振動(dòng)；1 453 cm－1附近歸屬為亞甲基的彎曲振動(dòng)；1 402、1 375、1 259 cm－1等附近為多糖、蛋白質(zhì)等的C—O—H彎曲振動(dòng)和亞甲基的變形振動(dòng)；1 081、1 029 cm－1附近分別為糖類的C—O和C—C伸縮振動(dòng)；950～710 cm－1范圍多個(gè)弱吸收峰，主要為糖類異構(gòu)體的特征峰。

2.3光譜預(yù)處理

運(yùn)用TQ8.0軟件對原始光譜進(jìn)行平滑、求導(dǎo)、MSC、SNV等優(yōu)化處理，運(yùn)用SIMCA-P10.0軟件對原始光譜進(jìn)行SNV-小波壓縮優(yōu)化處理，以減弱噪音、散射光、基線漂移等的干擾，提高光譜分析的準(zhǔn)確度，結(jié)果見圖1和表2、3。

表2　不同預(yù)處理方法的主成分累積貢獻(xiàn)率Table 2 Principal component cumulative contribution rates of different pretreatment methods

由圖1和表2可知，MSC+SD+ND（15∶5）和SNV+ SD+ND（15∶5）兩種光譜優(yōu)化方法，前10個(gè)主成分的累積貢獻(xiàn)率均大于95%，效果較好。表3顯示了正交信號校正及小波壓縮（orthogonal signal correction wavelet compression，OSCW）預(yù)處理的參數(shù)，OSCW選取了特征值大于1的3 個(gè)主成分，選用多貝西小波函數(shù)和離散小波變換法進(jìn)行壓縮；結(jié)果顯示，第3主成分的剩余平方和為26.07%，表明與牛肝菌分類變量無關(guān)的73.93%干擾信息已被消除。

表 3 OSCW預(yù)處理結(jié)果Table 3　Results of OSCW pretreatment

2.4不同種類牛肝菌馬氏距離分類模型

隨機(jī)選取20 個(gè)樣品為驗(yàn)證集，其余樣品為訓(xùn)練集，將10 種不同牛肝菌種類定義為1～10類；用TQ8.0軟件選擇MSC+SD+ND（15∶5）和SNV+SD+ND（15∶5）兩種光譜優(yōu)化方法建立不同種類牛肝菌的馬氏距離分類判別模型，結(jié)果見表4。由表4可知，基于MSC+SD+ND （15∶5）光譜優(yōu)化處理方法建立的分類模型，20 個(gè)驗(yàn)證集中9#和67#樣品分類錯(cuò)誤，其余樣品分類正確，樣品分類預(yù)測正確率為90%；經(jīng)SNV+SD+ND（15∶5）光譜 預(yù)處理建立 的模型，只有9#樣品分類錯(cuò)誤，其余樣品分類正確，預(yù)測正確率達(dá)95%。

表4不僅顯示了20 個(gè)驗(yàn)證集樣品的分類結(jié)果，驗(yàn)證集樣品的計(jì)算類別與真實(shí)類別之間的馬氏距離，還計(jì)算出驗(yàn)證集樣品與下一個(gè)最接近類別的馬氏距離，能反映兩類樣品的相似性。例如2#樣品真實(shí)類別為第1類（華麗牛肝菌），計(jì)算結(jié)果也為第1類，表明2#樣品分類正確，2#樣品到真實(shí)分類的馬氏距離為0.811；除真實(shí)值外與2#樣品最近的類別為第4類，馬氏距離為1.088，表明2#（第1類）樣品與第4類樣品的相似度較大，可以推測兩類牛肝菌樣品化學(xué)組分及含量相似。MSC+SD+ND （15∶5）和SNV+SD+ND（15∶5）兩種預(yù)處理方法建立的馬氏距離分類模型結(jié)果基本一致，如23#樣品計(jì)算分類到真實(shí)分類的距離及與最接近類別的距離最大，53#樣品馬氏距離最小。

表4　牛肝菌種類馬氏距離分類模型預(yù)測結(jié)果Table 4 Prediction results for boletus classififi cation by the Mahalanobisdistance classififi cation model

2.5PLS-DA

將MSC+SD+ND（15∶5）和SNV+SD+ND （15∶5）預(yù)處理后的光譜數(shù)據(jù)導(dǎo)入SIMCA-P軟件進(jìn)行PLS-DA，結(jié)果見圖2。圖2為前3 個(gè)主成分的三維得分圖，由圖2a可看出，不同種類牛肝菌樣品只有部分樣品可以很好的聚類，很多樣品出現(xiàn)離散分布，不易區(qū)分不同種類牛肝菌樣品，圖2b反映出不同種類牛肝菌分類效果明顯優(yōu)于圖2a的分類效果，但部分樣品的聚類效果不明顯如：磚紅絨蓋牛肝菌；不同種類牛肝菌樣品互相堆疊，難以鑒別牛肝菌種類，表明SNV+SD+ND（15 ∶5）和MSC+SD+ND（15∶5）光譜預(yù)處理方法結(jié)合PLS-DA分析不適宜用于牛肝菌種類鑒別。

圖 22 MMSSCC+SSDD+NNDD（　1155∶5）（a）和SSNNVV+SSDD+NNDD（1155∶55）（bb）預(yù)處理后PLS-DA分析的三維得分圖Fig.2　3D score plot of PLS-DA after MSC + SD + ND （15∶5） （a） and SNV + SD + ND （15∶5） （b） pretreatment

圖3　OSCW預(yù)處理后PLS-DA分析的三維得分圖Fig.3　3D score plot of PLS-DA after OSCW pretreatment

OSCW預(yù)處理后的光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行PLS-DA分析，結(jié)果見圖3，基于OSCW建立的PLS-DA分類模型能夠很好地將不同種類牛肝菌樣品區(qū)分開，可用于不同種類牛肝菌的鑒別分析。圖中9#樣品與該類（華麗牛肝菌）其他樣品的距離較遠(yuǎn)，結(jié)果與馬氏距離分類判別模型中9#樣品分類錯(cuò)誤的結(jié)果一致。與圖2相比，OSCW紅外光譜預(yù)處理方法能夠更有效地去除與分類變量無關(guān)的信息，保留有用信息，為不同種類牛肝菌的鑒別分析提供更可靠的依據(jù)。

3　結(jié) 論

采用傅里葉變換紅外光譜法測定了10 種牛肝菌的紅外光譜，根據(jù)牛肝菌的紅外吸收峰分析其成分特征。應(yīng)用平滑、求導(dǎo)、MSC、SNV、OSC-小波壓縮等方法對原始光譜進(jìn)行優(yōu)化處理。結(jié)果顯示MSC+SD+ND （15∶5）和SNV+SD+ND（15∶5）兩種預(yù)處理方法前10 個(gè)主成分累積貢獻(xiàn)率均在95%以上，OSCW預(yù)處理方法能有效去除與牛肝菌種類無關(guān)的干擾信息提高光譜分析的準(zhǔn)確度。

基于MSC+SD+ND（15∶5）和SNV+SD+ND （15∶5）預(yù)處理方法建立馬氏距離分類判別模型，驗(yàn)證集樣品的預(yù)測正確率分別為90%和95%，得到滿意的結(jié)果。馬氏距離分類模型不僅可以預(yù)測牛肝菌分類結(jié)果，而且可以看出與某一牛肝菌樣品最相近的種類及到該種類的馬氏距離，此方法可為牛肝菌等食藥用真菌的物種鑒定、鑒別提供科學(xué)依據(jù)。經(jīng)預(yù)處理后的光譜數(shù)據(jù)分別進(jìn)行PLS-DA分析，結(jié)果顯示，用MSC+SD+ND （15∶5）和SNV+SD+ND（15∶5）預(yù)處理結(jié)合PLS-DA分析，不能有效區(qū)分牛肝菌種類，不適宜牛肝菌種類鑒別分類；OSCW預(yù)處理后的光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行PLS-DA分析，能夠明顯區(qū)分不同種類牛肝菌樣品，結(jié)果滿意，可用于野生食用菌種類鑒別分析。

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Infrared Spectroscopy Combined with Multivariate Statistical Analysis to Quickly Identify Different Species of Bolete Mushrooms

YANG Tianwei1， 2， ZHANG Ji2， SHI Yundong3， LI Tao3， WANG Yuanzhong2，*， LIU Honggao1，*
（1. College of Agronomy and Biotechnology， Yunnan Agricultural University， Kunming650201， China；2. Institute of Medicinal Plants， Yunnan Academy of Agricultural Sciences， Kunming650200， China；3. College of Resources and Environment， Yuxi Normal University， Yuxi653100， China）

Fourier transform infrared spectroscopy combined with multivariate statistical analysis was used to establish a rapid method for the identifi cation of different species of edible bolete mushrooms. The infrared spectral characteristics of 93 bolete samples of 10 different species were analyzed. The original infrared spectra were pretreated by multiplicative signal correction （MSC）， standard normal variate （SNV）， second derivative， Norris smooth， orthogonal signal correction （OSC） and wavelet compression. The optimized spectral data were used to establish a mahalanobis distance classifi cation model and a partial least squares discriminant analysis （PLS-DA） model. The results showed that the characteristic absorption peaks of protein， polysaccharide and amino acid appeared at wavenubmers around 3 325， 2 934， 2 927， 1 637， 1 547， 1 402， 1 375，1 259， 1 453， 1 081， and 1 029 cm-1. The cumulative contribution rates were 95.58% and 95.54% in t he PLS-DA model based on MSC + SD + ND （15：5） and SNV + SD + ND （15：5） pretreatment， respectively. The Mahalanobis distance classification model was established base on the two pretreatment m ethods and the prediction accuracies of validation

set were 90% and 95% respectively. Bolete species could not be well distinguished by the PLS-DA model， when the data were pretreated by the MSC + SD + ND （15：5） and SNV + SD + ND （15：5）. PLS-DA analysis of the original spectra after optimization with orthogonal signal correction wavelet compression （OSCW） could distinguish different species of boletes. The Mahalanobis distance classification model could reflect the classification of the samples and compute the greatest similarity with the tested species， which can provide a reliable basis for the classifi cation of edible mushrooms and for the identifi cation of unknown species. OSCW pretreatment combined with PLS-DA analysis can effectively identify different species of boletes， providing an auxiliary method for the identifi cation of wild edible mushrooms.

infrared spectroscopy； boletes； discrimination； Mahalanobis distance； partial least squares discriminant analysis （PLS-DA）

2015-01-21

國家自然科學(xué)基金地區(qū)科學(xué)基金項(xiàng)目（31260496；31160409；31460538）；國務(wù)院農(nóng)村綜合改革專項(xiàng)（2014NG007-18）；云南省教育廳科學(xué)研究基金項(xiàng)目（2013Z074）

楊天偉（1989—），男，碩士研究生，主要從事野生食用菌資源研究。E-mail：yangtianweizj@126.com

王元忠（1981—），男，助理研究員，碩士，主要從事藥用植物和真菌資源研究。E-mail：yzwang1981@126.com

劉鴻高（1974—），男，教授，博士研究生，主要從事野生食用菌資源研究。E-mail：honggaoliu@126.com

TS201.2

A

1002-6630（2015）24-0116-06

10.7506/spkx1002-6630-201524020